[发明专利]一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重PCR引物组及监测方法

说明书

一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重PCR引物组及检测方法。提供了一种检测效率高、结果准确的、可同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重PCR引物组及检测方法。所述多重PCR引物组包括鲇爱德华氏菌引物对、柱状黄杆菌引物对、嗜水气单孢菌引物对和点状气单胞菌引物对。本发明设计了四对针对不同致病菌的PCR引物组，并利用该引物组建立了一个多重PCR反应，实现了同时、快速鉴定四种致病菌的目的，并且敏感性好，特异性高，相对于传统检测方法，本发明所需成本更低，操作更加简便，所需时间更短，针对性更强，可应用于多种含有鲇爱德华氏菌、点状气单胞菌、柱状黄杆菌和嗜水气单孢菌的环境中其中任何一种细菌样本的分析和检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种同时检测鲇形目养殖鱼类四种致病菌鲇爱德华氏菌、柱状黄杆菌、嗜水气单孢菌和点状气单胞菌的引物序列及检测方法。

背景技术

鲇形目鱼类已成为当前世界淡水水产养殖发展的重点：美国主要饲养斑点叉尾鮰；欧洲主要饲养革胡子鲇、多河六须鲇、斑点叉尾鮰；非洲主要饲养革胡子鲇；我国黄颡鱼、南方大口鲇、革胡子鲇、胡子鲇、长吻鮠、江黄颡鱼、大鳍鳠等作为特种水产品正大量饲养，目前发展势头很快，其中尤以黄颡鱼最受欢迎。黄颡鱼是我国主要淡水水域中分布比较广、具有比较高经济价值的小型鱼类，因其肉质细嫩、味道鲜美、肌间刺少，深受广大消费者的欢迎。近年来，在江苏、浙江、广东和四川省的部分地区，人工养殖鲇形目鱼类的规模和集约化程度不断增加，部分养殖户也因此成功而获得了较好的经济效益。然而伴随养殖规模的迅速扩大、集约化程度大幅度提高，各种疾病对鲇形目鱼类的危害也日趋严重，其中细菌性疾病就是对养殖鲇形目鱼类危害比较严重的一类疾病。

目前国内外报道的鲇形目鱼类细菌性疾病的病原主要包括鲇爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)，嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)和点状气单胞菌(Aeromonas punctata)。其中鲇爱德华菌(E.ictaluri)是鲇形目鱼类的高发病原，可引起斑点叉尾鮰的败血病及黄颡鱼的裂头病，致死率极高,危害极大；柱状黄杆菌(F.columnare)可感染宿主较多，几乎所有淡水鱼都可感染，病菌感染后会造成烂鳃，烂身体等，病灶皮肤受损，免疫力减弱，随后可因细菌性败血病造成死亡；嗜水气单孢菌(A.hydrophila)与柱状黄杆菌一样，可危害鱼的种类很多，且流行季节长，危害鱼的年龄范围大，可造成严重的出血性败血症；点状气单胞菌(A.punctata)也是鲇形目的一种常见病原，可造成细菌性肠炎和打印病的发生。鱼类细菌病的发生原因有很多种，主要包括密度过高，温度影响，底泥过多，水质恶化等。其中底泥过多和水质恶化会导致水体中病原细菌的大量生长，从而诱发鱼类细菌病的产生，所以在高密度养殖过程中，对底泥和水质中病原微生物的鉴定和监测极其重要。

然而传统的微生物鉴定法费时费力，以PCR(聚合酶链式反应)为代表的分子生物学及自动化控制技术的发展使得快速检测病原微生物成为可能。目前报道较多PCR法、PCR加杂交法等方法虽然大大提高了检测的灵敏度，简化了检测手续，但也存在一些不足之处。其中最局限的是上述方法在一次实验中只能检测一种微生物，检测微生物的种类非常少。而在普通PCR基础上发展起来的多重PCR(multiplex PCR，多重聚合酶链式反应)可以检测和分析更多的靶基因，大大提高了检测效率、降低了检测成本，成为医学和兽医学临床诊断的主要手段。然而相对于普通PCR，多重PCR的设计难度要高得多。传统PCR一般扩增一个片段，需要两条引物，而多重PCR一般至少扩增3个以上的片段，就需要至少6条引物。这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外还要考虑不同扩增子的长度以便凝胶电泳。更麻烦的是，DNA多聚酶对不同的引物的扩增效率不同，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，常常出现扩增效率不均衡问题，造成假阴性结果，其结果是扩增效率高的片段能够被很容易的检测到，而效率低的片段彻底沦为背景。同时还容易出现引物二聚体，给检测带来了难题。

发明内容