[发明专利]几丁质结合蛋白Bt‑CBP及其编码基因和制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于苏云金芽胞杆菌的几丁质结合蛋白及其编码基因和制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

几丁质,俗称甲壳素、甲壳质,是N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的多聚物,在自然界中，几丁质是含量仅次于纤维素的生物高分子物质。几丁质的降解主要是通过产几丁质酶的微生物完成。

微生物几丁质降解系统主要由内切几丁质酶、外切几丁质酶、乙酞己糖胺酶和与几丁质结合蛋白等组成。其中几丁质结合蛋白(chitin-bindingproteins，CBP)分散几丁质糖链，内切几丁质酶随机切割多糖链，生成几丁质寡糖；外切几丁质酶沿糖链末端降解几丁质，生成的几丁二糖在β-N-乙酰己糖胺酶或壳二糖酶作用下生成单糖。其中几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质,能起到分散几丁质糖链束的作用,对于不溶多糖降解起着决定性的作用，广泛存在于各种微生物、动物和植物中。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上研究最深入、应用最成功的杀虫细菌，已经广泛用于农业、林业、贮藏以及卫生等多种害虫的防治。它除了能产生杀虫晶体蛋白之外，还能产生包括几丁质酶、几丁质结合蛋白在内的多种活性物质。但是目前人们对于苏云金芽胞杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的认识还有限,这些因素对于苏云金芽胞杆菌及其几丁质酶、几丁质结合蛋白的应用造成限制。

发明内容

本发明的目的是要解决苏云金芽胞杆菌杀虫性能好，但抑制真菌病害能力较差的问题，提供一种来源于苏云金芽胞杆菌、具有高效抗病原真菌活性且制备方法简单的几丁质结合蛋白Bt-BCP及其编码基因和制备方法与应用。

技术方案：

一种几丁质结合蛋白Bt-CBP，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，由463个氨基酸组成。

几丁质结合蛋白Bt-CBP的制备方法，步骤如下：

(1)DNA序列扩增：以苏云金芽胞杆菌ATCC-35866菌株基因组为模板,以Up1和Dn1为上、下游引物，用高保真TransStartFastPfu DNAPolymeras进行PCR扩增；所述上游引物1如SEQ IDNo.3所示，下游引物Dn1，如SEQ IDNo.4所示。所得扩增片段的序列如No.5所示。

(2)一步法构建大肠杆菌表达质粒：使用全式金的无缝连接试剂盒，将所得扩增片段与NcoI和Xho I酶切后的pET28a(+)线性片段，按5:1的比例混合于PCR管中，50℃反应15～30min，之后将重组产物直接用于转化大肠杆菌DH5ɑ，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆,得到重组表达质粒pET28(+)Bt-CBP；

(3)构建大肠杆菌重组表达菌株：将重组表达质粒pET28(+)Bt-CBP转化至大肠杆菌BL21,挑选阳性转化子克隆,得到重组表达菌株E.coli Bt-CBP；

(4)几丁质结合蛋白Bt-CBP的诱导表达：将重组表达菌株E.coli Bt-CBP接入含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中,于37℃过夜培养活化后,然后按1％的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中,当OD₆₀₀达到0.6左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂,在25℃，180rpm条件下诱导培养8-12h；

(5)几丁质结合蛋白Bt-CBP的纯化：将步骤(4)经诱导的菌液移入干净的离心管中，4℃，离心收集菌体,用缓冲液洗涤菌体,再用缓冲液重悬菌体之后置于冰上超声破碎，破碎后的样品于4℃下离心，收集上清即为粗蛋白；粗蛋白用镍柱进行亲和层析纯化,得到几丁质结合蛋白。

本发明同时提供了上述几丁质结合蛋白在增强几丁质酶酶活性中的应用。

本发明还提供了所述的几丁质结合蛋白单独或与几丁质酶联合使用，在防治真菌病害中的应用。所述的真菌病害为黄瓜灰霉病菌或尖孢镰刀菌等真菌病害。

本发明的优点和积极效果：

本发明的积极效果是：

1.本发明首次从苏云金芽胞杆菌中克隆出几丁质蛋白的编码基因,通过构建原核表达载体获得了具有高活性的表达产物,制备过程简单,为几丁质蛋白的后续研究提供了简便方法。

2.本发明获得的几丁质结合蛋白Bt-CBP可以提高几丁质酶Bt ChiB的酶活3.6倍。