[发明专利]分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法

说明书

本发明具体涉及一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶（glucose‑6‑phosphate isomerase,GPI）活性的方法。本发明方法主要包括以下步骤：对照CK的测定，样品提取液制备，脱盐，酶促反应，GPI活性计算。本发明方法简便、快速、准确，具有良好的重复性，可作为李果实中GPI活性的测定方法。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸异构酶( Glucose-6-phosphate isomerase，GPI; EC 5. 3. 1.9)是一类具有多功能生物活性的天然蛋白质，它参与糖代谢的磷酸戊糖途径和糖酵解作用，催化葡萄糖-6-磷酸 ( glucose-6-phosphate，G-6-P) 和果糖-6-磷酸( fructose-6-phosphate，F-6-P) 的相互转化，从而催化F-6-P异构化为G-6-P。

李属蔷薇科李亚科李属植物，全世界广泛栽培，其中中国李是栽培种中最大的一个种。李酸甜适度，风味极佳。研究表明李果实发育的早期，果糖和葡萄糖含量较低，而蔗糖含量相对较高；果糖和蔗糖随着果实的发育成熟呈逐渐下降的趋势。随着果实的发育，葡萄糖增加显著，成为主要的可溶性糖。经测定，李果实中GPI 活性与葡萄糖含量显著正相关，与果糖含量呈显著负相关。因此能准确有效地测定出果实中GPI的活性变化，是探讨糖转化、积累的关键指标。

目前关于GPI活性的研究主要集中在人和动物上，植物上研究较少。本实验采用分光光度计法测定李果实中GPI活性，建立的方法准确可靠，简便快捷，是一种测定李果实GPI活性的有效途径，可为李成熟果实果糖转化为葡萄糖提供理论依据。

发明内容

本发明提供一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法，该方法准确可靠，简便快捷，是一种测定李果实GPI活性的有效途径。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法，包括以下步骤：对照CK的测定，样品提取液制备，脱盐，酶促反应，GPI活性计算。

其中，所述酶促反应的酶为6-磷酸葡萄糖脱氢酶，己糖激酶以及蔗糖转化酶。

其具体步骤为：

（1）对照CK的测定：蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖和果糖，葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下脱氢引起吸光值变化Abs1=（A1_CK-A0_CK）；

（2）样品提取液的制备：取0.15g冷冻的李果肉样品，用1.6ml提取液研磨至匀浆；

（3）脱盐：提取完成后4℃，12000g下离心20min，取上清液过G25脱盐柱，收集脱盐产物；

（4）酶促反应：取脱盐产物100ul于800ul反应体系测定，该反应体系含100mM pH为6.9的咪唑-HCl，5mM MgCl₂，0.5mM NAD，1mM ATP，100ul提取液，2U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，2U 己糖激酶，2U蔗糖转化酶，以加入10mM的蔗糖起始反应，于340nm处检测吸光值的变化Abs2=（A1-A0）；

（5）GPI活性计算：利用公式GPI= n·(Abs2-Abs1)/(6.22·w·t)计算GPI活性，其活性单位为nmol·g^-1·s^-1；其中，n为稀释倍数，6.22为吸光系数w为样品质量， t为反应时间。