[发明专利]一种成年大鼠心肌细胞分离方法

说明书

本发明提供一种成年大鼠心肌细胞分离方法，包括步骤：（a）预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；（b）大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；（c）迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；（d）将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca²⁺的灌注溶液灌注心脏；（e）心脏继续灌注混合消化酶液；（f）取下灌注后的心脏置于转移液中，去除心房和大血管去除心房和大血管，将心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞，筛网过滤细胞悬液，静置；（g）梯度复Ca²⁺；（h）完全培养基重悬复Ca²⁺后细胞沉淀，接种于包被后的细胞培养瓶中培养。本发明提供的成年大鼠心肌细胞分离方法可获得高质量、高产量、存活时间长的成年大鼠心肌细胞。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种成年大鼠心肌细胞分离方法。

背景技术

心肌细胞(Cardiomyocytes)是不能增殖，获得正常的单个心肌细胞是心肌电生理研究的基础。而大多数研究用的细胞都来自培养的新生鼠心脏，新生鼠的心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构、功能上存在很大的差异，作为心血管研究的生物学实验工具，成年心肌细胞的功能特性是其他发育阶段心肌细胞不可替代的，成熟心肌细胞的体外培养模型是必要的，但成年鼠心肌细胞的培养比较困难。本发明所提供得成年大鼠心肌细胞的分离方法可以获得高质量、高产量、存活时间长的成年大鼠心肌细胞。

发明内容

本发明的目的是建立一种获得高质量、高产量、存活时间长的成年大鼠心肌细胞分离的方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得成年大鼠心肌细胞：

成年大鼠心肌细胞分离方法的步骤包括：(a)预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；(b)大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；(c)迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；(d)将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca²⁺的灌注溶液灌注心脏；(e)心脏继续灌注混合消化酶液；(f)取下灌注后的心脏置于转移液中，去除心房和大血管去除心房和大血管，将心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞，筛网过滤细胞悬液，静置；(g)梯度复Ca²⁺；(h)完全培养基重悬复Ca²⁺后细胞沉淀，接种于包被后的细胞培养瓶中培养。

可选的大鼠为体重150-300g，饲养6-8周的SD大鼠。

可选的灌注溶液为4℃预冷后的含137 mM NaCl₂、4 mM KCl、1 mM MgCl、10 mMHEPES、0.33 mM NaH₂PO₄、10 mM D-葡萄糖、5 mM牛磺酸和10 mM BDM缓冲液。

可选的无Ca²⁺的灌注溶液灌注心脏的具体方法为灌流速度为3-5 mL/min，灌流时间为2-3 min。

可选的混合消化酶液为为0.05%-0.1%的胶原酶II、0.05%-0.1%胶原酶IV和0.05%-0.1%蛋白酶混合酶。

可选的灌注混合消化酶液的灌流速度为5-10mL/min，灌流时间为25-40min。

可选的转移液为含0.05-0.1%BSA的灌注溶液。

可选的过滤细胞悬液的筛网为孔径250μm的筛网。

可选的梯度复Ca²⁺的Ca²⁺终浓度依次为0.06mM、0.24mM、0.6mM和1.0mM；

可选的梯度复Ca²⁺的方法为用含不同Ca²⁺浓度的溶液重悬细胞沉淀，于37℃沉降10min后，吸弃上清。