[发明专利]一种成年大鼠心肌细胞分离方法

权利要求书

1.一种成年大鼠心肌细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：（a）预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；（b）大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；（c）迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；（d）将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca²⁺的灌注溶液灌注心脏；（e）心脏继续灌注混合消化酶液；（f）取下灌注后的心脏置于转移液中，去除心房和大血管，将心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞，筛网过滤细胞悬液，静置；（g）梯度复Ca²⁺；（h）完全培养基重悬复Ca²⁺后细胞沉淀，接种于包被后的细胞培养瓶中培养。

2.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述的大鼠为体重150-300g，饲养6-8周的SD大鼠。

3.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤c中灌注溶液为4℃预冷后的含137mM NaCl₂、4mM KCl、1mM MgCl、10mM HEPES、0.33mM NaH₂PO₄、10mMD-葡萄糖、5mM牛磺酸和10mM BDM缓冲液。

4.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤d中无Ca²⁺的灌注溶液灌注心脏的具体方法为灌流速度为3-5mL/min，灌流时间为2-3min。

5.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤e中混合消化酶液为0.05%-0.1%的胶原酶、0.05%-0.1%胶原酶和0.05%-0.1%蛋白酶混合酶。

6.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤e中灌注混合消化酶液的灌流速度为5-10mL/min，灌流时间为25-40min。

7.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤f中转移液为含0.05-0.1%BSA的灌注溶液。

8.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤f中筛网过滤细胞悬液使用的筛网为孔径250μm的筛网。

9.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤g中的梯度复Ca²⁺的Ca²⁺终浓度依次为0.06mM、0.24mM、0.6mM和1.0mM，梯度复Ca²⁺的方法为含不同Ca²⁺浓度的溶液重悬细胞沉淀，于37℃沉降10min后，吸弃上清。

10.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤h中的完全培养基为预热的含5mM肉碱、5mM肌酸、5mM牛磺酸5%FBS和1%双抗的M199完全培养基，包被细胞培养瓶为0.01-0.015mg/mL层黏连蛋白包被的细胞培养瓶。