[发明专利]含有新型插入位点的羊痘病毒载体和应用

说明书

本发明提供含有新型插入位点的山羊痘载体基因工程毒株GTPVΔ135/EGFP和绵羊痘病毒基因工程毒株SPPVΔ135/EGFP，它们的保藏变编号分别为CCTCC NO：V201714和CCTCC NO：V201715。它们缺失135ORF，并选择该处为新型插入位点，可以构建一系列重组病毒疫苗株。本发明还构建了表达小反刍兽疫病毒(PPRV)的H基因和H/F基因的重组羊痘病毒疫苗株。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种含有新型插入位点 的羊痘病毒，该病毒缺失了135 ORF，并选择该处为新型插入位点，该疫 苗株毒株免疫原性没有影响，表达外源基因的能力强于传统的TK基因插 入位点。本发明还包括以所述病毒为载体疫苗利用所述含有新型插入位点 的羊痘病毒疫苗株制备的羊痘疫苗以及它们的应用。

背景技术

羊痘病毒(Capripox virus，CPV)是痘病毒科(Poxviridae)、脊索动 物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)、羊痘病毒属(Capripox virus)成员，包 括山羊痘病毒(Goat poxvirus，GTPV)和绵羊痘病毒(Sheep pox virus)。 羊痘，是羊痘病毒引起的一种急性高度接触性的传染病，主要通过气溶胶 和紧密接触进行传播。羊痘主要分布于非洲、中东、印度、北欧、地中海 各国及德国、澳大利亚、美国等，特别是非洲的北部、中东和亚洲的部分 国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家，如印度、俄罗斯、蒙古等国 家均有本病的流行。我国贵州、新疆、福建、山西、辽宁、吉林、黑龙江、 江苏、四川、上海等都有过羊痘发生的相关报道。因为该病具有高致病率 和高致死率的特点，所以羊痘给养羊业造成巨大的经济损失，并且严重影 响国际贸易，因此OIE将其列为法定通报的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。现在防控用的疫苗都是体外传代致弱的疫苗株。而基因工程 疫苗的研究热点是TK基因，该基因作为插入位点已经普遍用于痘病毒和疱 疹病毒疫苗的研制中。

山羊痘病毒是双股DNA病毒，病毒基因组共有147个开放阅读框 (ORF)，编码密度为93％，所编码的蛋白质长度为53-2027个氨基酸不 等，基因组中间的区域(ORF024-ORF123)有与其它痘病毒同源的保守序 列，这些序列与病毒复制相关。羊痘病毒也和其它痘病毒一样，基因组包 括一个中间编码区和两端相同的末端反向重复序列(invertedterminal repeat，ITR)。

羊痘病毒作为载体已经广泛应用于羊病预防。TK基因由于其便于筛 选，已经成为痘病毒的常用插入位点。但是也存着问题，虽然该基因是病 毒复制非必需，但是缺失突变后，对病毒的复制有明显地影响。利用TK 插入位点，已经有表达羊蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、传染性脓疱病毒、 羊口蹄疫病毒等抗原基因的重组山羊痘病毒(Caufour P etal.Vaccine， 2004；Ma W et al.Arch Virol，2014；Zhang Q et al.，Wei Sheng Wu XueBao， 2014；Wade-Evans AM et al.Virology，1996；BNB；W et al.Vaccine，2010.) 的报道，但是该位点的缺失，导致了载体病毒自身的复制能力降低，进而 影响了病毒载体毒和插入的外源蛋白的免疫原性并且需要大剂量免疫 (Chen W et al.Vaccine，2010)，进而影响了其作为载体苗的免疫效力。 羊痘病毒在我国普遍流行，严重危害养殖业的发展而我国尚无应对措施， 所以能够研制出既保留了载体的免疫原性并且能够良好地表达外源基因的安全性强的新型疫苗是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫原性好和安全性强的羊痘载体(例 如，改造的山羊痘病毒AV41株和绵羊痘疫苗株)基因工程毒株及其在构 建疫苗株中的应用。本发明的羊痘载体基因工程毒株的免疫原性和安全性 优于目前本领域常用的利用传统TK插入位点构建的羊痘载体基因工程毒 株。