[发明专利]一种母血浆游离DNA文库的构建方法以及父源等位基因的分型方法

说明书

本发明公开了一种母血浆游离DNA文库的构建方法以及父源等位基因的分析方法。首先设计了一组扩增母血浆游离DNA中SNP的特异性引物组，包括720对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～1440所示。然后采集9‑20周孕妇外周血用于血浆游离DNA提取，并应用多重复合PCR扩增技术对进行游离DNA的文库构建；文库经纯化、定量后，在Ion Torrent^TM平台上机测序。使用同样的方法对相应的母血细胞和胎儿组织基因组DNA进行文库制备和测序。根据测序结果，选择母血细胞为纯合子的SNP位点，分析母血浆中游离DNA在相应位点上非母等位基因的百分比浓度，达到确定游离DNA中父源等位基因的目的。

技术领域

本发明属于生物学技术领域。更具体地，涉及一种母血浆游离DNA文库构建方法和父源等位基因的分型方法，包括设计母血浆游离DNA的文库构建和高通量测序方法和试剂，以及游离DNA中父源等位基因的确定方法。

背景技术

以往产前的胎儿遗传诊断主要基于有创取样，包括绒毛膜绒毛取样(chorionicvillus sampling，CVS)和羊水穿刺(amniocentesis)，这些诊断方法虽然准确率高，但其操作有创伤性，可导致宫内感染、流产和死胎等多种妊娠不良反应，且其取样时间均不可早于10周。1997年在孕妇血浆中游离胎儿DNA(fetal cell-free DNA，cff DNA)的发现，使无创产前检测成为可能，对避免有创取样带来的风险，有效保障母胎健康有重要的意义。进一步研究表明，cffDNA片段能够携带胎儿整个染色体组的遗传信息，从怀孕第4周开始在孕妇血浆中出现，孕7周后cffDNA可以一定的比例稳定地存在于母体外周血中，其含量随着孕龄的增加逐渐增高，直至分娩前迅速增加，并能够在胎儿娩出后48小时内迅速从产妇体内代谢排出，不受既往妊娠的干扰。因此，孕妇血浆中的cffDNA被认为是目前最理想的无创性胎儿检材。目前，cffDNA在胎儿性别诊断、单基因遗传性疾病、胎儿三体综合征等多种临床产前诊断中有广泛的应用。

在法医遗传学研究中，研究者一直致力于利用孕妇血浆cffDNA进行遗传标记的检测和父源等位基因的分析，以实现无创父权鉴定。基于一代毛细管电泳(CE)的STR分型系统是目前在法医遗传学研究中应用最广泛、最成熟的方法技术。然而，cffDNA浓度在母血浆总游离DNA(Cell-free DNA，cfDNA)中含量较低，一般认为小于20％，在孕早期中一般小于5％，且呈高度片段化，其大小主要集中在150～200bp范围；而常规的STR扩增子长度在100～350bp范围内且大小不均一，导致大片段父源STR等位基因得不到有效扩增而被强大的母体DNA背景掩盖此外，STR分型中容易出现的影子带(stutter band)等非特异产物，增加分析的难度，影响分型的准确性。

与STR相比，单个SNP位点因其分布广泛、突变率低、扩增片段短等特点使其具有较好的法医学应用前景，被认为是第三代DNA遗传标记。随着SNP数据库的不断完善以及相关检测技术的长足发展，越来越多的研究者开始采用SNP分型技术对母血浆游离DNA进行法医遗传学分析。按照SNP分型通量的大小可以分为：低通量的SNP分型方法有Sanger测序法，等位基因特异性杂交电泳法等；中通量的SNP分型方法有质谱法、SnaPshot法、高分辨溶解曲线分析法；高通量的SNP分型方法包括SNP基因芯片分型和基于新一代测序(Nextgeneration sequecing，NGS)平台的SNP分型。目前，越来越多的研究使用NGS技术对母血浆游离DNA进行目标SNP区域的父源等位基因检测和分析。

基于NGS技术的游离DNA检测其关键环节在于测序文库的构建。但是，现阶段主要采用芯片杂交捕获法(on-array hybrid-capture)进行高通量测序的文库制备，此法需要的模板DNA量较大，且需定制大量的区域特异性探针，通过杂交技术捕获目标SNP区域，成本高，实验周期长，技术流程繁琐，因此在大样本分析、技术转化和推广应用等方面均面临着巨大的挑战。

发明内容