[发明专利]一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法，在EV71的VP1蛋白第112‑113个氨基酸之间插入His‑FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统、Sf9细胞在无血清培养基中表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71衣壳蛋白VP1。本发明方法通过His FF的纯化一步就得到了可溶性的EV71蛋白，免除了之前传统繁复的CsCl2密度梯度离心的纯化方法，且得率比之前提到了3倍，为之后EV71亚单位疫苗的研制打下了基础。

技术领域

本发明涉及一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法。

背景技术

肠道病毒71型手足口病是由肠道病毒71型(简称EV71)感染所引起的一种急性传染病。好发于儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高，多数患者病情经过良好，少数重症患儿可发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等并发症，极少数病情危重，可致死亡。存活者可留有后遗症，严重危害儿童身体健康和生命安全，被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”。对其预防和治疗是当前医学界的热点之一。

昆虫杆状病毒表达系统(insect baculovirus expression vector system，IBEVS)基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立起来的表达体系，是将外源基因整合到杆状病毒基因组上形成重组杆状病毒，在昆虫细胞或虫体中可表达外源蛋白的一种真核表达系统。是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统之后建立起来的，现已成为基因工程四大表达系统之一。利用该系统获得的重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。但由于表达出来的EV71蛋白通过传统的CsCl₂密度梯度离心的纯化方法过程比较复杂，并且得率较低。

发明内容

为了提供一种更方便高效的获得重组蛋白EV71的方法，做出本发明。

本发明根据EV71已有结构，切除N末端部分不稳定的结构，构建重组蛋白，且在EV71蛋白的的loop区域氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统构建用Sf9细胞在无血清培养基表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71。

本发明提供一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法，在EV71的VP1蛋白第112-113个氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统、Sf9细胞在无血清培养基中表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71衣壳蛋白VP1；

将表达重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25-27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组EV71衣壳蛋白；

将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，Sf9的活细胞浓度为0.45×10⁶cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h；

所得培养结束后所得细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过HisFF柱，用200ml PBS洗柱子后，先用100ml含10mM咪唑的PBS溶液洗杂，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到重组蛋白。

在本发明的一种实施方式中，将表达loop区域氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25-27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组EV71蛋白。