[发明专利]检测A型副鸡嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测A型副鸡嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用。

背景技术

副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)是鸡传染性鼻炎的病原，该病临床症状为鸡的急性上呼吸道感染，鼻腔和鼻窦发炎，眼结膜发炎，流泪，病鸡产蛋量下降，生长缓慢。鸡传染性鼻炎频发于世界的各个地区，呈地方流行性，虽然该病致死率相对较低，但副鸡嗜血杆菌可在鸡群长期存在，降低鸡的生产性能，导致产蛋率降低，育成鸡生长迟缓，并且降低了病鸡抵御其它疾病的能力，在抵抗力较弱的情况下极易继发其它传染病而死亡，给养殖户造成巨大的经济损失，严重阻碍了养殖业的发展。

目前关于副鸡嗜血杆菌分子病原学的研究资料还很少，相关报道集中于诊治。对于鸡传染性鼻炎的诊断方法和疫苗免疫效果的评价方法如临床诊断、血凝试验等不适合大范围的样品检测，对于鸡传染性鼻炎疫情监测以及疫苗的有效评估均需要建立更为灵敏、快捷的检测方法。血凝素(HA)是Hpg抗原中重要的成分，也是Hpg分型的基础，具有较好的抗原反应性，可与Hpg的阳性血清发生反应，对于鸡传染性鼻炎的流行病学检测以及免疫效果的监测具有广泛的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种检测A型副鸡嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用，主要目的是提供一种简便、快速及准确检测A型副鸡嗜血杆菌抗体的方法。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种检测A型副鸡嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、血清稀释液、底物显色液、兔抗鸡酶标二抗、终止液、A型Hpg标准阳性血清和A型Hpg标准阴性血清；其中，所述包被酶标板是以A型副鸡嗜血杆菌重组血凝素蛋白作为包被抗原。

作为优选，所述A型副鸡嗜血杆菌重组血凝素蛋白的核苷酸序列表为SEQ.ID.No.1。

作为优选,所述A型副鸡嗜血杆菌重组血凝素蛋白的制备方法包括：

设计合成引物，以A型副鸡嗜血杆菌Hpg-8菌株的基因组为模板，通过PCR扩增得到血凝素的扩增产物，所述扩增产物连接其表达载体并同时进行双酶切以构建重组质粒；将挑选的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性质粒单克隆菌，所述阳性质粒单克隆菌在IPTG诱导下进行蛋白表达得到诱导产物，所述诱导产物依次经纯化和复性后得到重组血凝素蛋白；其中，所述合成引物为：

上游引物：5'-CGCGGATCCATGAAAAAAACTGCAATCG-3'，

下游引物：5'-CCGCTCGAGCTCGTTACCTTTAACTGAGAT-3'。

作为优选,所述洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4。

作为优选,所述血清稀释液为含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为含有过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。

作为优选,所述终止液为2M硫酸溶液。

作为优选,所述包被抗原的包被浓度为5.0μg/mL；所述包被酶标板经50g/L脱脂奶粉PBST封闭，装入密封袋中置于4℃保存。

作为优选,所述兔抗鸡酶标二抗的稀释倍数为1:2500。

另一方面，本发明实施例提供了上述检测A型副鸡嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

用血清稀释液以体积比1：200的比例稀释待检血清得到稀释血清；

向96孔酶标板每孔中加入100μ所述稀释血清，向酶标板各添加两孔A型Hpg标准阳性血清和A型Hpg标准阴性血清作为对照，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，再向每孔加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μL以体积比1:2500稀释后的兔抗鸡酶标二抗，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，向每孔中加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μL底物显色液，室温下避光作用10分钟；

向96孔酶标板每孔加入100μL终止液以终止显色反应；

用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(OD)值；