[发明专利]一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种飞行时间质谱直接测定蓝藻细胞的检测技术，属于蛋白质组学和环境分析化学技术领域。

背景技术

蓝藻作为原始而古老的藻类原核生物，气温较高时尤其是夏季，在适宜的水文、气象条件下易在富营养化的湖泊、水库以及河流中大量繁殖形成蓝藻水华。而许多蓝藻尤其是淡水蓝藻中最常见的铜绿微囊藻会产生微囊藻毒素为代表的有毒次生代谢产物，对人畜的肝脏及皮肤产生极大伤害，严重危害水体环境以及人类自身健康和生命安全。因此，对蓝藻水华中优势种群铜绿微囊藻的鉴别尤为重要。

目前对蓝藻的鉴别技术主要有：浮游植物半定量活检法，卫星遥感技术以及16S rRNA基因序列方法等，此类方法或耗时或耗力，需要具备丰富的专业知识以及复杂的前处理步骤，无法直接测定蓝藻细胞且鉴别的精确性不足。因此，快速、简便、高精度地鉴别蓝藻的需求迫在眉睫。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种软离子电离技术，且这一分析化学的手段在迅速、准确识别其它微生物方面有成功应用案例，但对蓝藻的鉴别还未有适宜的方法，特别是前处理的步骤，基质的选择和蛋白质结晶的方法一直是研究的重点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种以核糖体蛋白质为生物标识物，快速、简便、直接地测定蓝藻细胞并进行分类鉴别的飞行时间质谱方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，包括如下步骤：

(1)对待鉴别蓝藻细胞样品进行前处理；

(2)将步骤(1)处理后的样品滴入样品板上，再滴入基质溶液，室内风干；

(3)将步骤(2)得到的样品板放入飞行时间质谱测定仪进行测定，以核糖体蛋白质作为生物标识物，测定出的图谱与所选择的特征核糖体蛋白理论峰值进行比对后实现对蓝藻种类的鉴别。

步骤(1)中，所述的前处理，无需提纯蛋白质，只需破碎和离心即可获得核糖体亚单位。

步骤(1)中，所述的前处理具体过程为：将样品进行超声波除泡，离心后去除上清液，取沉淀物离心后再取沉淀，所得沉淀加入TMA-1缓冲液混匀，移入装有氧化锆-二氧化硅微粒的细胞破碎专用离心管，置入细胞破碎仪进行机械破碎；将机械破碎后的样品低速离心后取上清液；上清液再经高速离心后获得核糖体亚单位沉淀物。

其中，所述的TMA-1缓冲液为含10mM pH 7.8Tris-HCl缓冲液，30mM的氯化铵，10mM的氯化镁以及6mM的2-巯基乙醇。

其中，所述的低速离心，离心条件为5800g，4℃，离心25分钟；所述的高速离心，离心条件为64000g，4℃，离心4小时。

步骤(2)中，将步骤(1)处理后的样品加入混合液A混匀后，再取2μL滴于样品板靶位上，再滴入1.5μL基质溶液覆盖，在空气中自然风干；所述的混合液A为含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液；所述的基质溶液为含10mg芥子酸，0.5mL混合液A和0.5mL蒸馏水的混合溶液。本发明的基质溶液为测定结果中目标峰值的离子强度最强的芥子酸(SA)，而非α氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)。

步骤(3)中，所述的生物标识物为13个核糖体蛋白质，分别为L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14。这些生物标识物的选定为测定的54株保存的蓝藻藻株均存在的，而且在的多次重复测试中都可以检测到的离子强度最强的13个核糖体蛋白质。根据目前已公布的20株的铜绿微囊藻的全部或部分基因序列，得知在不同的株之间，某些核糖体蛋白质的分子量是不同的，即如果能够实际测定到这些不同，就可以把它们区别开来。在我们的实际测量中，确实观察到了同一个核糖体蛋白质在不同的株之间的不同分子量，所以，据此方法，可以实现在株水平的鉴别(高于属和种的水平)。

步骤(3)中，所述的飞行时间质谱测定仪为配备N₂的激光脉冲仪的Axima CFR Plus型飞行时间质谱测定仪，设定条件：m/z为2000-40000Da，氮气激光脉冲仪λ为337nm，脉冲宽度3ns，频率10Hz，平均不同位置发射500下激光脉冲，正线性模式。