[发明专利]一种用于制备6‑氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法有效
| 申请号： | 201710236750.2 | 申请日： | 2017-04-12 |
| 公开（公告）号： | CN106967704B | 公开（公告）日： | 2018-04-20 |
| 发明（设计）人： | 王旭东;修志龙;董悦生;王启斌 | 申请（专利权）人： | 山西新国大医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/84 | 分类号： | C12N9/84;C12N11/00;C12P37/06 |
| 代理公司： | 北京润平知识产权代理有限公司11283 | 代理人： | 严政,刘依云 |
| 地址： | 037006 山*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 制备 氨基 青霉 青霉素 酰化酶 分离 纯化 固定 耦合 方法 | ||
1.一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备含有青霉素酰化酶粗酶液和无机盐的无机盐混合溶液，该含盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.15-0.3g/mL；
其中，所述无机盐混合溶液的pH为5-8；
(2)将步骤(1)所得无机盐混合溶液与叔丁醇混合，然后进行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固体以及富含盐和青霉素酰化酶的下相溶液组成的三相分配体系；
其中，所述无机盐混合溶液与叔丁醇的体积比为1：0.2-1.5；
(3)向步骤(2)所得下相溶液中加入载体进行青霉素酰化酶的固定化；
其中，所述下相溶液的酶活为50-150IU/mL，若高于150IU/mL用水稀释至上述范围。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述无机盐混合溶液中无机盐的浓度为0.2-0.3g/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述无机盐为水溶性磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和卤化物中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述无机盐为水溶性磷酸盐和/或硫酸盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述无机盐为水溶性磷酸盐。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述青霉素酰化酶粗酶液为经细胞破碎后未处理的用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶粗酶液，或者为经细胞破碎后去除菌体等固体杂质后的用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶粗酶液。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述青霉素酰化酶粗酶液的酶活为50-300IU/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述分相的方式为离心分相，该分相温度为0-40℃、离心力为500-5000g、时间为2-60min。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述分相的方式为静置分相，该分相温度为4-30℃、时间为0.1-4h。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)的过程还包括：从所述上相溶液中回收叔丁醇并循环用于与无机盐混合溶液相混合的过程中。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，补加磷酸盐至无机盐占总体系的浓度为0.2-0.45g/mL。
12.根据权利要求1或11所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述载体的加入量为总酶活与载体重量之比为500-1000IU/g。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述载体为环氧基载体或活化的氨基载体。
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