[发明专利]一种鹿角胶中鹿、牛源性多重荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用

权利要求书

1.一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：

正向引物UF序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物UR序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQ ID NO.2所示。

2.一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测探针，其特征在于，包括：

鹿特异性探针LUP序列：5’-TAAGGAAACAACAACACTCTTTATGGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

牛特异性探针NP序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’，如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，鹿特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

4.一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物、权利要求2或3所述的探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。

5.根据权利要求4所述的一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：

(1)质控体系引物：

上游引物UF序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物UR序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQ ID NO.2所示；

(2)质控体系探针CntP：5'TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3'，如SEQ ID NO.5所示；

(3)质控体系Isqc序列：

CTGATGGTGCAACCGCTATCTAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGGAAAGAACACAAAACCCTGCCCTAGA，如SEQ ID NO.6所示。

6.根据权利要求4所述的一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括鹿和牛阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。

7.权利要求1所述的引物、权利要求2或3所述的探针或权利要求4～6中任一项所述的试剂盒在同时鉴别鹿角胶中鹿和牛源性成分中的应用。

8.一种同时鉴别鹿角胶中鹿和牛源性成分的多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA，选择靶基因，并进行引物设计和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的构建；

(2)使用权利要求4～6中任一项所述的试剂盒进行PCR扩增；

(3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定鹿角胶中是否含有鹿和牛源性成分。

9.根据权利要求8所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)是将引物及探针放入同一反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。

10.根据权利要求8所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR扩增条件为：95℃，10min；95℃，10s；63℃，35s，在此收集荧光信号，45个循环。