[发明专利]一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用

说明书

本发明提供一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用，该基因敲除方法包括分别获得表达Cas9和sgRNA的转基因生物，再将两种转基因生物杂交，获得共表达阳性个体。本发明简化了载体构建技术，提高了注射效率，对靶标序列的编辑可以在受精完成后持续进行，因而保证了编辑效率。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用。

背景技术

CRISPR/Cas9基因编辑技术是细菌和古细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA和病毒入侵的免疫机制，是由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸内切酶切割识别的外源双链DNA，诱发同源重组或非同源末端连接，进而实现在目的DNA上进行编辑。CRISPR-Cas系统对DNA分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修饰。2012年，Doudan研究小组首次将crRNAs：tracrRNA二元复合体改造为单链RNA嵌合体，并指导Cas9蛋白在特定位点剪切。目前，CRISPR-Cas9已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥等生物中成功实现了基因组定点修饰。尽管ZFN、和TALEN技术也具有高效的基因编辑效率，但CRISPR/Cas9定点基因编辑方面有独特优势。首先，CRISPR/Cas9的靶点在基因组中分布频率高，几乎每8bp就有一个靶点，TALEN的靶点在基因组的分布频率大概是1/125bp，而ZFN每500bp才有一个合适的靶点，CRISPR/Cas9系统更容易在需要突变的点附近筛选到高效的靶点。其次，CRISPR/Cas9在引入定点插入时比ZFN和TALEN具有更精确的优势，这是由于Cas9切割DNA两条链的功能分别属于两个功能域，通过突变其中的一个功能域使Cas9变成只切割一条链的切口酶，同时引入修复模板，这样大大降低了天然Cas9切割双链引入随机突变的概率。因此，CRISPR/Cas9基因编辑技术在研究基因的功能方面具有得天独厚的优势。

但现有基因编辑技术的编辑效率较低，操作较为复杂，亟待改进。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用，用于解决现有技术中基因编辑的效率较低等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基因敲除方法，包括分别获得表达Cas9和sgRNA的转基因生物，再将两种转基因生物杂交，获得共表达阳性个体。

在本发明的一些实施例中，所述sgRNA含有如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示序列中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述生物为家蚕，家蚕的中文学名为桑蚕，拉丁学名Bombyx mori Linnaeus，是一种以桑叶为食料的鳞翅目泌丝昆虫，属无脊椎动物，节肢动物门蚕蛾科蚕蛾属桑蚕种；将Cas9载体和sgRNA载体分别导入家蚕胚胎中，得到对应的目标转基因家蚕，将获得的目标转基因家蚕杂交，获得共表达阳性个体。

在本发明的一些实施例中，利用piggyBac重组表达载体将Cas9基因和sgRNA分别整合至家蚕基因组，含有Cas9基因的piggyBac重组表达载体由含有Cas9基因的表达盒插入到载体pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到，含有sgRNA的piggyBac重组表达载体由含有sgRNA的表达盒插入到载体pBac[3×P3-DsRed]的BglⅡ酶切位点得到。