[发明专利]一种L‑半胱氨酸荧光探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种L-半胱氨酸荧光探针制备方法，属于探针的制备技术领域。

背景技术

L-半胱氨酸是一种具有生理功能，在自然界中广泛存在的重要物质，它在动植物体内是各组织细胞用来防御有害物质和增加活力的一种氨基酸，也是组成蛋白质的20多种氨基酸之一，并且是唯一具有活性巯基（-SH）的氨基酸。L-半胱氨酸是乙酰辅酶、牛磺酸和还原谷胱甘肽的前体，同时还能与铁离子形成硫铁化合物。目前，研究表明，人体中半胱氨酸浓度的升高是引起心血管疾病及中风的重要因素，还会导致认知功能障碍，严重的会导致阿尔茨海默氏病。因此，发明一种能方便检测生理环境中L-半胱氨酸的方法具有重要的现实意义。

目前常用的L-半胱氨酸的方法主要有以下几种，如：电化学检测法、高效液相色谱法，分光光度法、电化学检测法，这些方法只能检测L-半胱氨酸的总量，并且样品需求量大、检测时间长，而且会对样品造成破坏，因此并不适于生物环境的L-半胱氨酸的检测。因此，探索方便廉价、能够定性定量检测L-半胱氨酸，并且可以对生物样品进行实时检测的方法非常重要。当有机荧光探针与特定目标物发生变化后，其荧光信号会发生变化，以达到检测的目的。荧光分析法具有出限低、灵敏度高、选择性好、取样量少、方法简洁快速等特征，并且可以对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时在线，形象具体地观察到信号变化。所以，发明能快速检测、易观查信号变化的L-半胱氨酸荧光探针是非常有必要的。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种能快速检测L-半胱氨酸的比值型荧光探针，简称探针4；本发明进一步提供了探针4的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种L-半胱氨酸荧光探针，其结构式如下：

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本发明的L-半胱氨酸荧光探针，能抗丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、溴离子、醋酸根、铜离子、谷氨酸、还原谷胱甘肽、硫化氢、高半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、钠离子、硝酸根、苯丙氨酸、磷酸根、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、单线态氧、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁基、抗坏血酸的干扰，特异性好。

上述的L-半胱氨酸荧光探针的合成路线如下：

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化合物4即为L-半胱氨酸荧光探针。

上述的L-半胱氨酸荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1）将二乙胺基香豆素置于圆底烧瓶中，随后加入1-Boc哌嗪，1-羟基苯并三唑（HOBT），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI），用二氯甲烷溶解，在常温下搅拌4小时，然后除去反应液中的二氯甲烷得到化合物2。

2）将化合物1用体积比为1:1的二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶液溶解，常温下搅拌0.5小时，然后除去反应液中的二氯甲烷和三氟乙酸得到化合物3。

3）将化合物2和NBD-磺酰氯置于圆底烧瓶中，用二氯甲烷溶解，随后滴加一滴三乙胺，在常温下搅拌1小时，然后除去反应液中的二氯甲烷，得到探针4。

上述制备方法，优选的，采用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的二氯甲烷；步骤2在使用化合物1之前，可以用硅胶层析柱进一步纯化；用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的二氯甲烷和三氟乙酸；所得化合物2，可以用硅胶层析柱进一步纯化；三乙胺的加入方式为滴加；采用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的二氯甲烷；所得探针4，可以用硅胶层析柱进一步纯化。

本发明的上述L-半胱氨酸荧光探针用于检测L-半胱氨酸。包括用于检测水环境中的L-半胱氨酸和生物样品的L-半胱氨酸。

上述应用，具体的，包括：

观察加入L-半胱氨酸荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为450 nm；或者，在365 nm光源照射下，用肉眼观察加入L-半胱氨酸荧光探针前后待测水环境的荧光变化；或者，观察加入L-半胱氨酸荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。

所述生物环境，可以是活细胞。

所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，580 nm处和481nm处的荧光峰值的变化；如果580nm处峰值升高，481nm处峰值降低，则说明含有L-半胱氨酸。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。

所述荧光变化是指：在365 nm光源照射下，荧光明显增强。