[发明专利]基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法

说明书

一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，属于新型蛋白富集技术领域。本发明通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，核酸以及核酸结合蛋白会被氧化石墨烯所吸附，形成氧化石墨烯‑核酸‑核酸结合蛋白复合物。离心收集复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，最后收集上清液中的核酸结合蛋白即可。本发明成本低，操作简单，提取过程不到1分钟，可以简单高效的提取核酸结合蛋白，对于核酸结合蛋白质谱研究具有重要意义。

技术领域

本发明涉及的是一种生物检测领域的技术，具体是一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法。

背景技术

核酸结合蛋白包括DNA结合蛋白和RNA结合蛋白，参与调控多种细胞功能，包括DNA复制和转录，RNA加工和翻译，基因沉默以及端粒长度的维持等。RNA结合蛋白可以与RNA形成核糖核蛋白复合物进而调控RNA的合成和降解，也可以与非编码RNA比如microRNA结合调控信使RNA(mRNA)的转录后加工。DNA结合蛋白包括核小体蛋白和转录因子，在DNA复制，转录以及修复的过程中发挥着非常重要的作用。核酸结合蛋白表达或功能的缺失会导致许多疾病的发生，比如癌症和代谢性疾病。由于核酸结合蛋白重要的生物学功能，使得其在细胞内的蛋白质谱以及在不同生理病理条件下的活化状态的研究变得尤为重要。

对核酸结合蛋白研究常用的方法包括染色质免疫沉淀，电泳迁移率实验，染色体捕获技术，DNA或RNA亲和层析，并应用质谱对核酸结合蛋白进行鉴定。这些方法或以单个或多个基因为中心，研究与其结合的蛋白，或者是以蛋白为中心，研究与其结合的核酸片段。这些技术的特点是专一性高，但是通量低，不能作为核酸结合蛋白组学研究的方法。近几年发展了一些以基因为中心的，可以高通量研究DNA结合蛋白或者RNA结合蛋白的方法。比如，蛋白微阵列芯片技术，通过人工合成并串联上百个已被证明可以和蛋白结合的DNA片段从细胞裂解液中筛选出DNA结合蛋白(Hu et al.,2009)。mRNA免疫共沉淀技术利用可以特异性结合mRNA的抗体，通过富集mRNA从而鉴定到RNA结合蛋白(Castello et al.,2012)(Baltz et al.,2012)。这两种方法虽然可以鉴定到一定量的核酸结合蛋白，但是由于操作复杂，成本高的原因，在核酸结合蛋白质组学研究中的应用有很大的局限性。直到现在仍然没有一种通用的提取核酸结合蛋白的方法，因此发展一种简单高效的核酸结合蛋白提取方法变得尤为必要。

通常情况下，核酸结合蛋白在细胞中的丰度很低，因此对核酸结合蛋白特异性的富集将有助于对其后续的分析。由于核酸结合蛋白与核酸结合的特性，因此可以通过富集核酸从而提取到核酸结合蛋白。传统的核酸提取的方法基于苯酚-氯仿体系，在提取过程中会丢失绝大多数的核酸结合蛋白，因此需要发展一种在保证核酸结合蛋白不丢失的前提下富集核酸的新方法。

纳米材料比如碳纳米管，石墨烯和氧化石墨烯由于其出色的力学，热力及导电性能被广泛应用于生物医学的研究中，比如生物传感器，药物载体等。以往的研究表明，纳米材料可以通过π-π堆积的作用力稳定的吸附单链核酸。2012年Zhang等人利用碳纳米管吸附核酸的特性，从细胞中提取核酸并利用质谱鉴定到2595个蛋白(Zhang et al.,2012)，该方法虽然简单，但是核酸结合蛋白提取的特异性只有24％。

发明内容

本发明针对现有技术只能提取核酸，核酸结合蛋白会在提取过程中全部损失，所以无法用来提取核酸结合蛋白的缺陷，提出一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，该方法成本低，操作简单，提取过程不到1分钟，可以简单高效的提取核酸结合蛋白并有助于疾病发生发展相关的核酸结合蛋白的研究。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，然后收集上清液中的核酸结合蛋白即得。