[发明专利]用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法

权利要求书

1.用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

ThdF-F3:5’-GCGATCGTCACCGATATC-3’；

ThdF-B3:5’-GGTAATCGGCAGCTTAGC-3’；

ThdF-FIP:5’-CCACTTCATCACTGGCGTCAATTCACATCGACGGTATGC-3’；

ThdF-BIP:5’-GCGAATCGGCATTGAACGCGCCGTCGACCATAAACAG-3’；

ThdF-LF:5’-GCCTGCGGTATCGATGATAT-3’；

ThdF-LB:5’-ATTGAACAGGCGGATCGG-3’。

2.用于检测产气肠杆菌的试剂盒，包括权利要求1所示的LAMP引物组、DNA聚合酶、反应液、显色剂、荧光染料、封闭液、阳性对照和阴性对照；

其中，所述外引物、内引物、环引物的摩尔比为：(1～2)：(4～8)：(2～4)。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：反应液为含有20mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：荧光染料为SYBR GREEN Ⅰ。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：显色剂为钙黄绿素与锰离子配合物，所述钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：10～15。

6.非疾病诊断目的的产气肠杆菌的快速检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品DNA；

（2）利用权利要求1的LAMP引物组对待检样品DNA进行恒温荧光扩增或恒温扩增；

所述恒温荧光扩增反应在qPCR仪器中进行，实时读取荧光信号；若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性；

所述恒温扩增反应在恒温装置下进行，反应结束后加入1～2μL的显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现荧光黄绿色，则判断为阳性，若呈现橙色，则判断为阴性；

所述恒温荧光扩增反应的25μL反应体系含有：ThdF-F3 0.02μM、ThdF-B3 0.02μM、ThdF-FIP 0.16μM、ThdF-BIP 0.16μM、ThdF-LF 0.08μM、ThdF-LB 0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL、荧光染料0.5μL，用超纯水补齐到25μL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。

7.根据权利要求6所述的非疾病诊断目的的产气肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述恒温扩增反应的25μL反应体系含有：ThdF-F3 0.02μM、ThdF-B3 0.02μM、ThdF-FIP0.16μM、ThdF-BIP 0 .16μM、ThdF-LF 0.08μM、ThdF-LB 0.08μM、反应液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待检样品DNA 2μL，用超纯水补齐到25μL；反应体系混匀后，加入20μL密封液；恒温荧光扩增反应的条件为60～65℃反应55～65min。