[发明专利]一种新型抗菌肽Mytichitin‑A在毕赤酵母中的高效制备

说明书

技术领域

本发明涉及抗菌肽Mytichitin-A首次通过基因工程的方法成功表达于毕赤酵母中且具有较强抑菌活性，属于生物技术领域。

背景技术

抗菌肽是在诱导条件下，由机体细胞产生的用于对抗外源性致病菌的一种活性多肽。近些年，对抗菌肽的研究越来越多，不仅仅因为其在杀灭细菌和真菌、抗病毒、抗肿瘤等多方面的作用，更因为其在人体内易消化、无毒副作用、热稳定性好、无药物残留、不易产生耐药性等诸多优点，使其被世界公认为最具潜力的抗生素和食品防腐保鲜剂替代品，具备巨大的开发潜力。Mytichitin-A是从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)的血清中分离纯化得到，是一种十分典型的阳离子抗菌肽，由55个氨基酸残基构成，分子量为6261.55Da，包含三对二硫键，同源的抗菌肽结构域分析结果显示，其序列中第17到第55个氨基酸残基构成了几丁质结合结构域。研究发现，抗菌肽Mytichitin-A对革兰氏阳性菌有明显的抑菌活性，特别是对金黄色葡萄球菌极其敏感。这使得Mytichitin-A在食品、农业、医药上都具有巨大应用潜力。

毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种新的酵母表达系统被人们发现。由于毕赤酵母与酿酒酵母的分子及遗传操作方式相似，并且毕赤酵母表达外源蛋白的水平比酿酒酵母高出好多倍，这使得毕赤酵母成为目前应用最广泛的表达外源蛋白的真核表达系统。这个新的表达系统有很多优点1、产生的蛋白来源于自身的非常少，且培养毕赤酵母的培养基只含有少量的蛋白，这使得分泌的外源蛋白成为酵母培养液中蛋白的主要组成部分，可作为蛋白纯化的第一步。2、毕赤酵母拥有可严格调控的乙醇氧化酶基因启动子，这是目前启动能力最强的启动子之一，能够以甲醇作为唯一碳源，驱动外源基因在毕赤酵母中表达。3、整合到毕赤酵母基因组上的外源基因，随着染色体的复制而复制，可稳定遗传。4、pH适应范围广，可通过调节培养基的pH值来抑制蛋白水解酶的活性，从而降低蛋白酶对目的蛋白的水解。

以毕赤酵母为表达载体，利用甲醇进行诱导表达，首次获得了抗菌肽Mytichitin-A的高表达菌株，并经抑菌试验实验，确定其对致病菌金黄色葡萄球菌有很强的抑菌作用。经检索本发明在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新型重组抗菌肽Mytichitin-A在毕赤酵母中高效制备的方法。技术方案概述如下：以毕赤酵母为宿主细胞，将新型抗菌肽Mytichitin-A的基因序列插入到pPICZαA载体，并成功转入毕赤酵母GS115中，利用甲醇就行诱导表达，对表达产物进行纯化及活性鉴定。终产品是新型重组抗菌肽Mytichitin-A的高表达菌株，发酵液上清中抗菌肽产量达45.5μg/mL。所制备重组抗菌肽对多种病原菌均具有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果格外突出。

本发明的另一目的是提供一种新型重组抗菌肽Mytichitin-A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明还提供一种包含上述重组抗菌肽Mytichitin-A的克隆载体、表达载体或宿主细胞。

更进一步地，所述克隆载体为pUC19，所述表达载体为pPICZαA，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

所述新型重组抗菌肽Mytichitin-A在毕赤酵母中高效制备的方法，具体包括如下步骤：

(1)按照SEQ ID NO：2合成抗菌肽Mytichitin-A目的基因并插入到载体pUC19，获得重组质粒pUC-Mytichitin-A，采用表达载体pPICZαA以及EcoRI和KpnI两个限制性酶切位点，构建重组质粒pPICZα-Mytichitin-A；

(2)通过电转化的方法，将SacI酶线性化的重组质粒pPICZαA-Mytichitin-A转入毕赤酵母GS115细胞，构建基因工程重组菌；

(3)筛选pPICZαA-Mytichitin-A的阳性克隆子进行诱导表达，获得存在于酵母发酵液上清中的目的蛋白。

进一步的，采用pPICZαA这一外分泌型表达载体，载体上有可严格调控的乙醇氧化酶基因(Aox1)启动子及α-因子分泌信号(α-factor)，促进外源蛋白分泌表达。

进一步地，诱导表达的条件为，当用BMGY培养基培养pPICZαA-Mytichitin-A阳性克隆子的OD值为6.0-8.0时，换成BMMY培养基，并用甲醇进行诱导表达。

更进一步地，经1.0％甲醇诱导96h，目的蛋白产量达45.5μg/mL。