[发明专利]一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法

说明书

本发明公开了一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3‑三氯丙烷（TCP）的方法。首先合成能降解1，2，3‑三氯丙烷及其中间产物的卤烷脱卤酶基因、卤醇脱卤酶基因和环氧化物水解酶基因，基因序列及其编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示；然后构建包含上述基因的枯草芽孢杆菌整合载体，载体转化枯草芽孢杆菌，通过基因异位整合及抗性基因敲除的方法，将上述基因整合至枯草芽孢杆菌基因组中，获得可以分泌表达卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶的枯草芽孢杆菌工程菌。该工程菌对TCP及其中间产物都具有很好的降解作用，可实现TCP的完全降解，具有降解效率高、TCP耐受性强且遗传稳定等特点，应用前景好。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法。

背景技术

1，2，3-三氯丙烷（TCP）是一种人工合成的氯代有机化合物，是制造油漆涂料和土壤杀虫剂的重要原料，被广泛应用于工业和农业生产。但TCP具有高毒性和难降解的特点，广泛使用造成了该物质在土壤和地下水中的大量积累，对人类健康和生态环境造成了巨大的威胁。

目前降解TCP的方法有：物理、化学和生物方法。物理法包括真空抽滤和活性炭吸附。但TCP易挥发、难吸附，所以物理法不能有效解决TCP污染问题。化学法主要利用强氧化剂和强还原剂处理TCP，具有工艺简单的特点。但强氧化剂和强还原剂的使用会严重破坏生态环境。与物理和化学法相比，生物降解法具有成本低和能够将有害物质完全降解的优点，已成为降解环境污染物的有效方法。目前，有研究利用固定化酶（卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶）构建体外TCP降解途径，使TCP转化成甘油。但固定化酶存在制作过程复杂、生产成本高和难以重复利用的问题，特别是在低浓度的TCP污染环境中，固定化酶具有明显的局限性。另外，一些研究构建了能降解TCP及其中间产物的工程菌。但构建的菌株存在TCP耐受性差、遗传不稳定和降解效率低的问题。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有TCP降解技术的缺陷和不足，提供一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法。

本发明的另一目的是提供一种降解1，2，3-三氯丙烷的枯草芽孢杆菌工程菌。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种卤烷脱卤酶基因（dhaA31），其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种卤烷脱卤酶（haloalkanedehalogenase, DhaA31），其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

一种卤醇脱卤酶基因（hheC），其核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种卤醇脱卤酶（halohydrindehalogenase, HheC），其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

一种环氧化物水解酶基因（echA），其核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种环氧化物水解酶（epoxide hydrolase, EchA），其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种降解1，2，3-三氯丙烷的枯草芽孢杆菌工程菌，构建方法为：首先合成能降解1，2，3-三氯丙烷（TCP）及其中间产物（2，3-二氯-1-丙醇和环氧氯丙烷）的卤烷脱卤酶（DhaA31）基因、卤醇脱卤酶（HheC）基因和环氧化物水解酶（EchA）基因，序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示；然后构建包含上述基因的枯草芽孢杆菌整合载体，载体转化枯草芽孢杆菌，通过基因异位整合及抗性基因敲除的方法，将上述基因整合至枯草芽孢杆菌基因组中。所得枯草芽孢杆菌工程菌分泌表达上述基因编码的卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶。