[发明专利]一种CTCF蛋白可结合DNA片段及在CTCF活性检测中的应用

说明书

本发明涉及一种CTCF蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个CTCF蛋白结合框，每个CTCF蛋白结合框的序列独立地为SEQ ID NO:1‑16中的一种；还涉及该DNA片段的应用；还涉及一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内CTCF的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析CTCF作为转录因子在一些病理学发展中所起的作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种CTCF蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。

背景技术

CTCF(CCCTC binding factor)即CCCTC结合因子由CTCF基因编码，是一类在真核生物中分布极其广泛的多功能转录因子，在基因转录水平发挥至关重要的作用，参与多种生物学功能的调控。CTCF历经了近3亿年的进化而没有发生明显改变，具有高度的保守性。

研究显示，CTCF蛋白可通过其特有的11个锌指结构与多种蛋白质和DNA结合，发挥其生物学功能。如CTCF可以激活或抑制启动子调节相关基因的转录，可以构成染色质隔离子和绝缘子，调节X染色体的功能，调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡。

CTCF蛋白结合位点的改变可能造成其活性的改变，引起细胞功能紊乱，最终导致疾病的发生，甚至诱发恶性肿瘤。因此，检测CTCF的转录调控活性对于探知细胞内部的病理发生机制十分重要。然而，目前检测CTCF内源性活性仍然依靠Western Blot或qRCR等方法，虽然特异度高，但灵敏度低，而且操作复杂，检测到的只是CTCF蛋白含量的差异，并不能直接体现其活性的改变，而CTCF的活性与肿瘤的发生发展有着密切的关系，我们需要检测的不仅是CTCF的转录本或蛋白质含量，而是需要检测CTCF结合至有效位点以影响转录的活性。因此，找到一种简单可靠的检测内源性CTCF活性的方法对于CTCF的研究显得极为重要。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法。

发明内容

发明人通过研究发现，CTCF蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性，其结合的DNA核心序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G)。

基于以上研究，本发明提供了一种CTCF蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个CTCF蛋白结合框，所述CTCF蛋白结合框的序列为5’-CCGCGNGGNGGCAG-3’(N表示A、T、C、G，如SEQ ID NO:1-16所示)。

优选地，当包含多个CTCF蛋白结合框时，每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的CTCF蛋白结合框之间的间隔序列为所述间隔序列为AT。

优选地，序列如SEQ ID NO:17所示。

本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内CTCF转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内CTCF转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

S1：将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内CTCF转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为衡量CTCF转录调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所示荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。将CTCF转录调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。