[发明专利]一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物RIP1183的制备方法

权利要求书

1.一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物RIP1183的制备方法，其特征在于：RIP1183是由7个氨基酸组成的多肽，其化学名称：乙酰-L-酪氨酰-L-赖氨酰-L-脯氨酰-L-缬胺酰-L-苏氨酰-L-谷氨酰胺-L-苯丙酰胺；化学结构：

Ac-Tyr-Lys-Pro-Val-Thr-Asn-Phe-NH₂

制备抗多重耐葡萄球菌感染药物RIP1183的步骤如下：

(1)制备Fmoe-Phe-MBHA Resin

称取Rink Amide MBHA Resin 1g倒入反应柱中，加入10mlDMF，常温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，10~50℃反应5~30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10~50℃反应10~60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次， DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干，加入Fmoc-Phe-OH 0.54g， TBTU 0.45g、DMF 10ml、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml，于常温反应2小时，茚三酮检测显阴性，树脂用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Phe-MBHA Resin；

(2)制备Fmoc-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin

在步骤(1)的Fmoe-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Asn（Trt）-OH 0.84g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；

(3)制备Fmoc-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin

在步骤(2)的Fmoc-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc- Thr（tBu）-OH 0.56g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；

(4)制备Fmoc-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin

在步骤(3)的Fmoc-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Val-OH 0.48g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；

(5)制备Fmoc-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin

在步骤(4)的Fmoc-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc- Pro-OH 0.47g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin ；

(6)制备Fmoc-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin

在步骤(5)的Fmoc-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Lys（Boc）-OH 0.66g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，获得Fmoc-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin；

(7)制备Fmoc- Tyr（tBu)-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin

在步骤(6)的Fmoc-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin 中，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阳性，抽干，加入Fmoc-Tyr（tBu)-OH 0.7g，TBTU 0.45g、HOBt 1ml、DIEA 0.4ml、DMF 10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测显阴性，抽干，加入脱帽试剂20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂，常温反应20分钟，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，茚三酮检测呈阳性，抽干,用乙酸酐、DIEA、DCM混合液进行乙酰化，反应1-2小时，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为AC-Tyr（tBu)-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHAResin；

(8)制备粗品

把吹干的AC-Tyr（tBu)-Lys（Boc）-Pro-Val-Thr（tBu）-Asn（Trt）-Phe-MBHA Resin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷的切肽试剂TFA 9.5ml、H₂O 0. 25ml、Tis 0.25ml，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，切割液加适量的二氯甲烷进行悬蒸，温度控制在39℃±1℃，将悬蒸好的切割液，放冷，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用10%的冰乙酸和30%的乙腈混合液溶解，低温冷冻干燥24小时，获得RIP1183粗品0.69g，经HPLC测定纯度为80%；

（9）纯化

将步骤（8）的RIP1183粗品0.69g溶于13ml水中，水浴溶解，过滤，滤液上样于C₁₈色谱柱Kromasil-C₁₈，20mm *250mm,流动相为如下A、B液体的混合物：A：0.1%三氟乙酸加99.9%水；B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈；从A液体占混合物比例100%开始梯度洗脱，期间B液体占混合物比例逐渐升高，直至占100%，流速为10ml／min，检测波长为： 215nm；收集目标峰的流出液，用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰，浓缩冻干，获得成品；共获得成品0．47g，MW：909，经HPLC测定纯度大于98%，质谱测定结果与RIP1183理论分子量一致。