[发明专利]一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用，本发明针对14种高危型HPV设计的引物和探针，可特异性的实现快速对HPV E6/E7 mRNA的检测与鉴别。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，为HPV的普查和宫颈癌防治提供了快速准确的分子检测方法，同时大大降低了检验成本，具有重要的推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleicacid sequence-basedamplification，NASBA)技术和分子信标熔解曲线技术的人乳头瘤病毒E6/E7基因检测技术。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科，是一种嗜上皮性病毒。它对表皮和粘膜鳞状上皮具有特殊嗜性，为无包膜的双链环状DNA病毒，具有高度的特异性，且在人和动物中分布广泛。HPV基因组共由3个基因区组成，包括早期区(EarlyRegion，E区)、晚期区(Late Region，L区)和与非编码区(Uncoding Region，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。UCR含有HPV基因组DNA的复制起点和调控HPV病毒的转录与复制表达所必需的元件。

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)经过完全测序后可归类成120多种基因型，其中有50余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，导致尖锐湿疣糜烂，甚至可能引起癌症的发生。根据其是否可以引起癌变，HPV亚型可分为“低危”型和“高危”型，前者主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)；后者的感染是引发宫颈癌的主要致病因素。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年内痊愈，但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。研究发现，中国妇女HPV感染率的年龄组分布曲线呈现出两个高峰(20-24岁和40-44岁)，HPV的感染正日益普遍的影响着中国妇女的生活质量和身心健康。

宫颈癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，而高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV的感染使得宫颈癌的相对危险性增加了250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。事实上，约99.7％的宫颈癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV 16、18、31、33、35的反复或持续感染所致。因此，高危HPV病毒是目前最为明确的致癌病毒，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。

临床上HPV分型检测是应用分子生物学的方法检测病毒的核酸，主要集中在以靶序列扩增为基础的检测技术(如荧光-PCR法)和以信号放大为基础的检测技术(如杂交捕获法)。国内市场上HPV核酸检测试剂盒检测的靶序列主要针对HPV的L1基因序列和全基因组序列，这些方法是以病毒基因组DNA作为靶序列，检测样本载有的病毒类型及负荷量。实际上宫颈细胞的病变程度不仅与病毒类型以及负荷量相关，也与致癌基因的活动程度密切相关。HPV E6/E7信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)是病毒癌基因的转录产物，它在宫颈组织中表现出癌基因的活性，HPV E6/E7mRNA水平与病变的严重程度相关。研究表明，与HPVDNA检测相比，HPV E6/E7mRNA检测可能是一种更有效的方式，为感染高危型HPV的妇女提供了更准确的风险预测。