[发明专利]测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学中表面等离子体共振技术的应用方法，具体涉及一种用于测定芦丁与蛋白质相互作用结合水平的表面等离子体共振分析方法。

背景技术

表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术是一种在分子间相互作用的分析领域中广泛使用的方法。其基本原理为利用入射光照射SPR传感芯片，使得入射光产生的倏逝波与传感芯片表面金属的表面等离子波发生共振，影响出射光的性质；此后在传感芯片表面发生相互作用反应，引起共振条件的变化，导致出射光性质发生变化，对其进行监测即可实现对相互作用反应的检测。在一般的SPR分析过程中，相互作用反应的一个参与物往往通过共价键、静电作用、疏水作用等等方式被固定于SPR检测芯片表面，然后将另一个(或几个)反应的参与物溶解后流动通过该检测芯片表面。当发生相互作用反应时，反应物的结合或解离将导致检测芯片的表面性质发生改变，反映为仪器信号的改变。SPR技术可以进行快速、灵敏、无标记的分析，经常被用于测定相互作用反应的速率常数、平衡常数等物理化学数据。

芦丁(rutin)是一种黄酮类化合物，在自然界，特别是植物中广泛分布，在一些植物的根、茎、叶、果实等器官和组织内都可以被发现。芦丁的结构式如下：

芦丁具有明显的生理活性，是常见的食品和中药，例如荞麦、银杏、槐米、枸杞、芸香、益母草、芦荟、柴胡、桉叶，以及烟草中的重要活性成分。芦丁的结构式如图1所示。芦丁具有较强的抗氧化活性，在人体中可以维持血管壁的张力、提高其弹性，降低血管壁脆性和渗透性，因而可以改善微血管循环、降低血脂和胆固醇含量，可以在心脑血管疾病的治疗中发挥作用。此外，芦丁还具有一定的抑菌和抗衰老作用，并且可以影响胰岛素的分泌并提高胰岛素受体亲和力，在糖尿病治疗领域中也有一定的应用。芦丁进入人体后，需要通过与多种蛋白质发生相互作用以实现其生理、药理功能，例如其浓度较高时需要与血液中的人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)发生结合从而随着血液循环而被输运到其他器官或组织，然后再解离以发挥生理功能，其功效发挥也和其与生物酶或者特异和非特异受体的结合有关。因此，研究芦丁与蛋白质相互作用的有关过程，特别是求得其与多种蛋白质发生结合反应的平衡常数，对其药理、药代动力学等研究具有重要意义。

作为一种快速、无标记、实时的分析手段，SPR法本质上适合于芦丁-蛋白质相互作用的分析，但在实现过程中却存在着困难，即芦丁的溶解性问题。SPR是一种质量敏感型的分析方法，其信号强度取决于传感芯片表面附近(50纳米内)被测物质量的大小，因此当被分析物是芦丁等小分子物质时，它必须在水环境中有足够大的溶解度，以形成足够强的信号。特别地，为了模拟生理环境，SPR分析过程往往使用含有无机盐的缓冲溶液来制备样品溶液，这进一步导致了芦丁溶解度降低的问题。已有专利方法中并无使用SPR法研究芦丁与蛋白质相互作用的方法。因此，有必要通过分析步骤的改进，改善芦丁在水溶液中的溶解性，并以此为基础开发基于SPR的芦丁-蛋白质相互作用结合水平的快速分析测定方法。

发明内容

为了弥补现有方法的不足，特别是芦丁溶解度问题导致的分析困难，本发明的目的是提供一种基于表面等离子体共振原理的新型相互作用分析方法，实现对芦丁和蛋白质相互作用结合水平(即结合反应的平衡常数)的测定。

本发明的分析方法包括传感芯片的清洁、芯片表面的羧基化修饰、蛋白质溶液pH的筛选、芯片表面羧基的活化、蛋白质的共价结合、芦丁的溶解与稀释、蛋白质与芦丁相互作用过程的测定、数据分析等步骤。具体过程如下，各步骤须依次进行。

1、传感芯片的清洁。

当SPR传感芯片(通常为镀金玻璃片)为可拆卸式结构时，将传感芯片整体浸没于由浓氨水、30％过氧化氢、水按体积比1:1:5混合而成的溶液中，并置于60-95℃环境中至少10分钟，然后以水清洗，干燥后使用。当传感芯片为不可拆卸式结构(即金属层直接镀于棱镜表面)时，在芯片表面检测窗口位置滴加上述溶液，并置于低于90℃但尽可能高(不损坏棱镜等结构)的温度下至少30分钟，然后以水洗净表面并干燥后使用。也可以使用全新传感芯片。

优选的，每次分析流程均使用全新传感芯片，为镀有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成后弃去。

2、芯片表面的羧基化修饰。