[发明专利]一种从植物内生真菌中提取小分子活性成分的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然产物加工应用技术领域，主要涉及一种小分子天然活性产物的提取制备方法。

背景技术

内生真菌是普遍存在于健康植物组织但并不会引起植物自身症状的一类微生物。相关数据显示约有50％以上的植物体内存在植物内生真菌,现存有的植物内生真菌保守估计有170000余种。大量研究表明，绝大部分植物内生真菌产生的小分子次级代谢产物与寄主植物本身所产生的天然活性产物具有很大的相似性。尤其在医药植物的内生真菌研究这方面，这一特性更有普遍应用，药用植物内生真菌次级代谢产物中的小分子活性成分已经逐渐成为了一种天然药理活性成分提取的替代来源。现在提取植物内生真菌次级代谢产物小分子活性成分的相关研究方面，一般采用高温干燥菌丝，再粉碎浸提的方法。该方法缺点显著，主要存在三个方面的问题：其一、在提取过程中菌丝中含有的有效活性成分可能会因为高温干燥而分解,而且单纯机械粉碎并不能使大部分菌丝细胞破碎完全，这导致许多有效成分被困锁于真菌细胞内，造成提取效率降低；其二、大量分泌于真菌培养液中的刺激代谢产物不能得到有效提取分离；其三、不加区分的过滤、干燥与浸提手段致使微生物细胞和培养液残余营养物质的多糖、蛋白质分子、油脂类、色素杂质和小分子活性成分混杂在一起，对有机小分子活性成分提取分离与应用造成困难。所以寻求高效,简单并且完善的提取方法是促进植物内生真菌研究以及相关发展的所面临的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从植物内生真菌中提取小分子活性成分的方法,旨在寻求使该类提取高效,简单并且完善的技术手段。

本发明是这样实现的,一种从植物内生真菌中提取小分子活性成分制备方法,所述提取制备方法包括以下步骤：

步骤一、将发酵罐或液体培养基中扩大化培育完成的植物内生真菌菌体悬浮液进行首次加压粗孔过滤操作，并用洁净水多次洗涤菌丝，将菌丝体和培养液进行初步分离；

步骤二、上述分离所得的菌丝体用2-3倍体积的洁净水浸泡20min,在-10℃-30℃温度区间快速反复冻融4-6次，所得冻融液体加压过滤(0.15MPa维持10min)，与S101步骤所得培养液合并经再次细孔过滤，除去大分子杂质；得到滤液，滤渣舍弃；

步骤三、将S102步骤所得滤液进行真空浓缩，所得高浓度水溶液与S101步骤所得菌丝体混合，再按极性由低到高的顺序加入不同有机溶剂进行低温超声萃取60-80min,所得有机溶剂分离流出；

步骤四、S103步骤所得不同极性的有机溶液经大孔树脂柱层析吸附除去残余多糖、蛋白质分子、油脂类、色素杂质，得到含小分子活性成分的有机溶液，真空冷冻干燥以除去溶剂,得到小分子活性成分物质；

步骤五、S104步骤所小分子活性成分的混合物分别用¹³C-NMR技术手段加以分析，根据其化学位移的分布区间来推测其是否含有潜在活性结构的物质，为精确分离提供参考依据。

进一步说明步骤一所涉及的粗孔过滤使用的是300-400目数的不锈钢粗效过滤网。

进一步说明步骤二所涉及的反复冻融过程，应使系统冷冻至-10℃保持4min,再迅速升温至30℃，升温时间控制在5-10min，于30℃保持恒温10min,再次重复该过程。

进一步说明步骤二所涉及的细孔过滤过程，使用的是不锈钢微孔过滤网，孔径约0.05-0.1mm。

进一步说明步骤三所涉及的超声低温萃取温度恒温在25℃，使用的有机溶剂应按极性从小到大的顺序萃取。

进一步说明步骤四所涉及的大孔树脂一般情况下使用AB-8型大孔树脂。

进一步说明步骤五所涉及的¹³C-NMR技术分析所得物质过程，主要依据化学位移δ的出峰区域来判断，主要包括：

饱和碳原子区(δ<100)：饱和碳原子若不直接和杂原子(O、S、N、F等)相连，其化学位移值一般小于55。

不饱和碳原子区(δ90-160)：烯碳原子和芳碳原子在这个区域出峰；当其直接与杂原子相连时，化学位移值可能会大160；炔碳原子则在其它区域出峰，其化学位移值范围为70-100。

羰基或叠烯区(δ>150)：该区域的基团中碳原子的δ值一般大于160。其中酸、酯和酸酐的羰基碳原子在160-180出峰，酮和醛类物质在200以上区域出峰。

本发明的另一目的在于提供一种低温冻融提取系统,设置包括加热/冷冻空气循环机组、洁净水补充系统、自动恒压机组、时间控制系统以及粗效过滤网；