[发明专利]一种从植物内生真菌中提取小分子活性成分的方法

权利要求书

1.一种从植物内生真菌中提取小分子活性成分的方法,其特征在于,所述小分子天然活性产物的提取制备方法包括以下步骤:

步骤一、将发酵罐或液体培养基中扩大化培育完成的植物内生真菌菌体悬浮液进行首次加压粗孔过滤操作，并用洁净水多次洗涤菌丝，将菌丝体和培养液进行初步分离；

步骤二、上述分离所得的菌丝体用2-3倍体积的洁净水浸泡20min,在-10℃-30℃温度区间快速反复冻融4-6次，所得冻融液体加压过滤(0.15MPa维持10min)，与S101步骤所得培养液合并经再次微孔过滤，除去大分子杂质；得到滤液，滤渣舍弃；

步骤三、将S102步骤所得滤液进行真空浓缩，所得高浓度水溶液与S101步骤所得菌丝体混合，再按极性由低到高的顺序加入不同有机溶剂进行低温超声萃取60-80min,萃取温度设定为20℃-24℃，所得有机溶剂分离流出；

步骤四、S103步骤所得不同极性的有机溶液经大孔树脂柱层析吸附除去残余多糖、蛋白质分子、油脂类、色素杂质，得到含小分子活性成分的有机溶液，真空冷冻干燥以除去溶剂,得到小分子活性成分物质；

步骤五、S104步骤所小分子活性成分的混合物分别用¹³C-NMR技术手段加以分析，根据其化学位移的分布区间来推测其是否含有潜在活性结构的物质，为精确分离提供参考依据。

2.如权利1要求所述的从植物内生真菌中提取小分子活性成分的制备方法,其特征在于,所述使用的方法是粗效过滤使菌丝体和培养液分离后采用反复冻融来破碎真菌细胞；菌丝体用2-3倍体积的洁净水浸泡20min,在-10℃-30℃温度区间快速反复冻融4-6次，所得冻融液体加压过滤(0.15MPa维持10min)。

3.如权利1要求所述采用的是低温超声萃取方法，将真空浓缩后的含活性成分的水溶液与冻融完成后所得菌丝体混合，再按极性由低到高的顺序加入不同有机溶剂进行低温超声萃取60-80min,萃取温度设定为20℃-24℃。

4.如权利1-3任意一项所述的从植物内生真菌中小分子活性成分的提取制备方法,其特征在于,使用的低温冻融提取系统的主要设备包括：加热/冷冻空气循环机组、粗效过滤网、温度传感控制器、自动恒压机组和洁净水补充系统以及时间控制系统。其中加热/冷冻空气循环机组通过温度传感器反向传回的监测数据调整循环空气的温度；自动恒压机组通过压力传感器进行恒压操作，并结合时间控制系统的指令来进行不同压力水平的时间控制。

5.如权利1-3任意一项所述的低温超声萃取系统采用的主要设备包括：恒温水循环机组、超声装置、微孔过滤网、温度传感控制器、冷凝循环管系统以及时间控制系统。