[发明专利]个性化肝细胞的培养和扩增方法及其应用

说明书

本发明涉及一种个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，对获取的肝实质细胞进行基因修饰，以抑制P53基因的表达或功能；步骤二，将步骤一中经过基因修饰的肝实质细胞置入肝细胞增殖培养基中进行培养和扩增，获得肝细胞；步骤三，将步骤二获得的肝细胞，置入肝细胞分化培养基中培养获得肝实质细胞。根据上述方法制备得到的肝细胞，克服了以往无法在体外长期培养和扩增肝实质细胞的难题，为肝细胞的应用提供了无限的细胞来源。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种个性化肝细胞的培养和扩增方法。

背景技术

肝脏是动物体内以代谢功能为主的重要生命器官，调控着多种生理功能，主要包括解毒，储存肝糖原，合成分泌性蛋白质以及生成胆汁等。肝脏本身具有强大的再生能力，正常肝脏经三分之二部分肝切除后，残留的成熟肝细胞可快速增殖，并完全取代和恢复缺失肝脏的体积和功能。但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝硬化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能不断下降，最终危害人们的健康和生命。

全世界受肝病影响的患者超过5亿，一旦发展为终末期肝病或急性肝衰竭，目前唯一有效的治疗手段是进行肝脏移植。但是由于肝脏供体持续紧缺以及术后免疫系统对异体器官的排斥，移植手术的发展受到了严重的制约。最近基于肝细胞治疗的技术受到了广泛的关注，其中包括肝细胞移植，肝脏组织的体外重建和生物人工肝等，被认为是全器官移植较理想的替代方式。然而，由于成熟肝细胞无法长期体外培养和增殖，该方法仍旧依赖于捐献的供体肝脏，并且不能改变移植后的免疫排斥。此外，体外培养的肝细胞还是非常好的药物肝脏代谢模型以及肝炎病毒研究模型，被广大制药公司和研究机构大量使用。因此如何获得稳定而大量的肝细胞来源，成为目前最迫切的需要。

在过去的数十年中，研究者进行了各种各样的尝试，期望在体外重现肝细胞特有的强大增殖潜能。然而迄今为止，尚无报道可在体外长期培养和增殖各种动物的正常肝实质细胞。为了克服原代肝细胞在体外的生长限制，研究者通过导入SV40病毒蛋白(大T抗原或小T抗原)实现了正常肝细胞的永生化(如Fa2N-4细胞系)。此外一些来自于肿瘤的细胞系被建立起来，并表现出一些成熟肝细胞的形态和功能(如HepaRG细胞系)。虽然这些细胞可在体外无限培养和增殖，但出于安全性的考虑以及肝细胞功能上的异常(包括p450活性的异质性)，它们的实际应用受到极大限制，通常仅作为药物代谢和毒性筛查模型，在一些制药公司被少量使用(VallierL.，HepswithPep:DirectReprogrammingintoHumanHepatocytes，CellStemCell,14,March6,2014，267-269)。

近来，利用干细胞或其他细胞来分化获得肝细胞被认为是未来肝细胞的重要来源。可诱导多能干细胞(iPS)和谱系重编程技术的诞生更是使得建立个体化肝细胞，并最终实现个性化医学变得可能。目前已有多个报道可成功地将哺乳动物的胚胎干细胞(ES)和iPS细胞定向分化成具有肝脏功能的细胞。此外，研究者还成功地将体细胞通过谱系重编程直接转分化为肝细胞，并证明这些细胞可在肝脏中增殖及重建肝脏功能。但是，无论由ES细胞，iPS细胞还是谱系重编程分化获得肝细胞，都不可能达到百分之百的效率，残存的干细胞注射入动物体内后可能形成畸胎瘤和腺瘤，因此严重影响了这些细胞的应用。此外，ES细胞取材困难且受到伦理学上的严格限制，而iPS细胞和谱系重编程均涉及多个外源基因导入，其安全性和肝细胞功能与上述永生化的肝细胞相似，因此它们的实际应用也有较大限制。

因此，最理想的肝细胞来源还是原代肝细胞，如果能实现原代肝细胞的长期体外培养和增殖，并保持正常肝细胞遗传学和功能的稳定性，将极大推动人类对肝脏的认识和肝病的诊疗。

肝细胞在各种肝病的移植治疗中，在用于辅助肝功能设备的制备中、在药物毒性筛选和新药研发中以及在肝病和肝炎研究等领域的需求巨大。由于原代肝细胞无法在体外长期培养并很快失去功能，且原代肝细胞的药物代谢能力表现出显著的个体间差异，因此无限量供应有功能的个性化肝细胞将极大促进药物开发以及生物人工肝和肝细胞移植的最终临床应用。