[发明专利]个性化肝细胞的培养和扩增方法及其应用

权利要求书

1.个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：对获取的肝实质细胞进行基因修饰，以抑制P53基因的表达或功能；

步骤二：将步骤一中经过基因修饰的肝实质细胞置入肝细胞增殖培养基中进行培养和扩增，获得肝细胞；

步骤三：将步骤二获得的肝细胞，置入肝细胞分化培养基中培养获得成熟肝细胞。

2.根据权利要求1所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，对步骤一中所述的肝实质细胞进行基因修饰的方法选自基因导入、基因编辑或RNA干扰中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述基因导入使用的基因选自抑制P53表达或功能的基因，所述抑制P53表达或功能的基因选自SV40病毒大T抗原基因、HPV病毒E6E7基因或泛素连接酶基因；所述泛素连接酶基因选自Mdm2、Hdm2、COP1、Pirh2或ARF-BP1基因中的至少一种,所述的基因编辑选自CRISPR/Cas9、TALEN或ZFN方法中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述基因导入的方法选自病毒载体介导的基因表达或非病毒载体介导的基因表达。

5.根据权利要求1所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述的肝实质细胞为哺乳动物肝实质细胞，所述哺乳动物肝实质细胞选自小鼠肝实质细胞、大鼠肝实质细胞、恒河猴肝实质细胞、猩猩肝实质细胞或人肝实质细胞中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述经过基因修饰的肝实质细胞是附着在培养支持物上，再加入肝细胞增殖培养基进行培养和扩增的，所述培养支持物采用胶原蛋白或细胞外基质蛋白预包被；所述细胞外基质蛋白选自Matrigel基质胶，所述的培养支持物是指培养皿或培养板。

7.根据权利要求1所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述的肝细胞增殖培养基包括基础培养基，所述的基础培养基选自MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640、WilliamE、NeurobasalE或Fischers培养基中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述的肝细胞培养基还包括营养成分，所述营养成分包括血清、血清替代物、生长因子、Wnt信号通路的激动剂、Rho相关蛋白激酶抑制剂、ALK5激酶抑制剂中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述的血清替代物选自KnockOut^TM血清替代物、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液、N2营养添加物、B27营养添加物中的至少一种；所述的生长因子选自表皮生长因子、成纤维细胞生长因子-2、肝细胞生长因子、血小板细胞生长因子或胰岛素生长因子中的至少一种；所述的Wnt通路激动剂选自CHIRP98014、TWS119、CHIRP99021、Wnt3a或R-Rspondin中的至少一种；所述的Rho相关蛋白激酶抑制剂选自thiazovivin、Y-27632或Blebbistatin中的至少一种；所述的ALK5激酶抑制剂选自SB431542、A83-01或RepSox中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的个性化肝细胞的培养和扩增方法，其特征在于，所述的肝细胞分化培养基由基础细胞培养基和添加物组成，所述基础细胞培养基选自MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640、William E、Neurobasa l或Fischers培养基中的至少一种；所述的添加物包括血清替代物、肝细胞生长因子、地塞米松、人抑瘤素-M或ALK5激酶抑制剂中的至少一种。所述的ALK5激酶抑制剂选自SB431542、A83-01或RepSox中的至少一种。