[发明专利]一种制备蜂毒肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备蜂毒肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

蜂毒是工蜂毒腺分泌的一种具有芳香气味的透明液体，主要由多肽类、活性酶类、非肽类物质组成，蛋白质多肽类物质是蜂毒中的主要成分，约占蜂毒的70%-80%。蜂毒肽是由26个氨基酸残基组成的多肽，分子量为2840Da，约占蜂毒干重的50%，其一级结构氨基酸残基序列为NH₂-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Glu-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Glu-Gln-COOH。蜂毒肽具有抗炎、抑菌、抗癌、抗辐射、抑制血小板凝集等作用，可有效地治疗肩周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎等多种疾病，在医药领域具有一定的应用。

蜂毒肽是从蜂毒中分离纯化得来的，具有生物活性高、不污染环境等特点，可以研制开发出机体免疫调节剂等产品，具有很大的市场开发前景，因而引起了学术界广泛的关注。

用溶媒萃取、三柱层析、溶媒萃取与三柱层析相结合等方法制备蜂毒肽，其产品制备过程繁琐，生产周期较长，有机溶剂使用量大。Kreil（Kreil, G. Structure of melittin isolated from two species of honey bees [J]. Febs Letters, 1973,33(2): 241-244.）报道了溶媒萃取制备蜂毒肽的方法，蜂毒肽得率约为20%（质量分数），纯度在60.3%（质量分数），制备方法简便，提取1g蜂毒肽需要200mL正丁醇，正丁醇的需求量大，造成环境的严重污染。刘岭和杨文超（1.刘岭,李昌全,黄雪强.蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤作用研究[J].中国生化药物杂质.2003,24（4）：16-17 2. 杨文超, 蜂毒肽的分离纯化及其抗辐射作用机理研究[D],福建农林大学,2007.）报道了三柱层析法制备蜂毒肽，蜂毒肽得率约为48.67%（质量分数），纯度为97.32%（质量分数），纯度较高，解决了有机溶剂用量大的问题，但是提取过程复杂，提取时间较长。张文礼和徐彭（1.张文礼,孙井元.蜂毒肽的分离提纯方法[P],中国, 101089017A.2007-12-19. 2.徐彭,欧阳永伟,黄敬耀,张桂英,肖诚,刘波. 从蜂毒中分离纯化蜂毒肽的实验研究.中草药[J]. 2000, 31(12): 892-894.）报道了溶媒萃取与层析法相结合制备蜂毒肽，蜂毒肽得率约为47%（质量分数），纯度为电泳纯，缩短了三柱层析法所需时间，与Kreil（Kreil, G. Structure of melittin isolated from two species of honey bees [J]. Febs Letters, 1973,33(2): 241-244.）的制备方法相比较，减少了正丁醇的使用量，但在提取过程中仍需大量的正丁醇，不利于环境保护。

上述分离纯化方法生产工艺复杂，生产周期长，得率低，纯度低，且污染严重。

发明内容

本发明的目的是为了克服蜂毒肽现有分离纯化技术的不足，提供一种快速制备蜂毒肽的方法，该方法所制备的蜂毒肽，得率高，纯度高，周期短，能耗低，污染小的制备蜂毒肽的方法。

本发明获得蜂毒肽的提取率质量分数为49%，纯度质量分数为98%。

本发明的一种制备蜂毒肽的方法，步骤如下：

①蜂毒的除杂

将粗蜂毒加入到pH为4.0-5.5的缓冲溶液中，使其浓度为0.5-1.5mg/mL，以2500-3500r/min离心3-7min去除不溶性的杂质，得上清液；

所述粗蜂毒是将蜜蜂蛰刺排出的毒液用蒸馏水溶解，经冷冻干燥所得；

所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

所述除杂为除去不溶于缓冲溶液的物质。

②蜂毒肽的分离

将①中所得上清液过葡聚糖凝胶G-25柱，用蒸馏水洗脱，流速控制在25-30mL/h，测定各分离组分的分子量，在葡聚糖凝胶柱下收集分子量为2840Da的层析组分经冷冻干燥得固体样品；

所述葡聚糖凝胶G-25为葡聚糖用英文字母G表示，G反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围，25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克；

所述洗脱为以蒸馏水作为流动相连续通过色谱柱固定相，流动相与固定相作用力比样品弱，样品各组分按先后顺序从固定相洗出；