[发明专利]一种鱼类单细胞悬液的制备方法

说明书

本申请公开了一种鱼类单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：PBS试剂、D‑Han氏液和IV型胶原酶液的配制，准备鱼的肾脏组织块，用PBS冲洗肾脏组织3次以上；将组织块放人冰浴中的平皿里，加入PBS，剪切成细小碎块，将组织块放入高通量组织研磨器离心管中；在离心管中加入IV型胶原酶，同时加入PBS定容至4ml，放入氧化锆球进行研磨，将组织匀浆酶解消化；过滤，离心，PBS冲洗，离心，弃上清液除去细胞碎片，过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。本发明采用酶解研磨法，结合了研磨法和酶解法两种方法的优点，通过酶解研磨对组织处理更充分，解决了制备鱼类单细胞悬液细胞得率低和细胞活力低的问题。

技术领域

本申请属于动物单细胞制备领域，具体地说，涉及一种鱼类单细胞悬液的制备方法。

背景技术

随着医学及细胞组学的快速发展，单细胞悬液制备已经越来越重要。单细胞悬液制备研究中，国外最先见于对小鼠畸胎瘤组织用胰蛋白酶解离制备单细胞悬液的研究中，国内最早见于对喉癌组织鳞状上皮细胞单细胞悬液的制备。组织单细胞悬液的用途广泛，可应用于细胞培养、流式细胞术检测等。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是在20世纪60年代末发展起来的一种对细胞的物理和化学性质进行快速定性和定量的技术，该技术以大量的单个细胞为检测单位，具有研究结果客观准确、灵敏且同时能够检测多个参数等优点，各种新型特异性荧光染料的不断开发和检测技术的不断进步，促使FCM的应用由临床医学领域逐渐向其他生物学领域快速扩展。

Sequeira等(Sequeira T,Vilanova M,Lobo-Da-Cunha A,et al.Flowcytometric analysis of molt-related changes in hemocyte type in male andfemale Penaeus japonicus[J].The Biological Bulletin,1995,189(3):376-380.)1995年对日本对虾(Penaeus japonicus)在蜕皮间期和蜕皮时期的血细胞亚群组成情况进行报道，Magnadottir等(óTTIR B ó T M,óTTIR H KóTTIR S G.Characterisation ofmonoclonal antibodies to separate epitopes on salmon IgM heavy chain[J].FishShellfish Immunology,1996,6(3):185-198.)1996年对鲑鱼血液单克隆抗体进行研究。国内关于流式细胞术在水产动物研究中的应用较早见于对鲍、泥蚶、牡蛎，对虾等的倍性、血细胞分群，细胞周期等的研究，之后部分鱼类的血液血细胞倍性分析，DNA含量测定，细胞凋亡等方面的研究陆续被报道，但都主要集中于血液和血细胞的特性检测，对鱼类活体器官组织做流式单细胞悬液制备及检测尚未见报道。

目前将动物组织处理为单细胞悬液方法主要有机械法(剪切、研磨、吹打，网搓等)，化学试剂处理法(EDTA，EGTA阳离子螯合剂等)，酶解法(胰酶、胶原酶、弹性蛋白酶，透明质酸酶、溶菌酶)等三种方法，处理方法不同对组织的处理效果也各有优劣。机械法操作简便，较为适合处理一些含纤维组织较少的软组织，但此法易产生较多组织团块和细胞碎片，必须用细胞筛过滤去除团块。Ca²⁺、Mg²⁺在组织细胞间起黏连作用，化学试剂处理法则主要是通过化学试剂处理将Ca²⁺、Mg²⁺置换出来从而破坏黏连作用以达到分离细胞的目的。该方法在制备黏连性较大的实体脏器的单细胞悬液的过程中如肿瘤组织等，可以有效的防止单细胞再聚集，但此方法可能会影响实验结果，如EDTA能够和缓冲液中的Ca²⁺发生螯合反应或对细胞膜结构造成破坏。