[发明专利]一种鱼类单细胞悬液的制备方法

权利要求书

1.一种鱼类单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)PBS试剂、D-Han氏液和IV型胶原酶液的配制；

2)准备试验鱼的肾脏组织块，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；

3)将肾脏组织块放入冰浴中的平皿里，然后加入PBS，将肾脏组织剪切成为1mm³细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将肾脏组织块放入SCIENTZ 50高通量组织研磨器5ml离心管中；

4)将IV型胶原酶液在水浴中加热，取2ml加热后的IV型胶原酶液加入离心管中，同时加入水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球进行研磨，研磨好后打开研磨器开关将组织匀浆放入恒温水浴振荡器中酶解消化；

5)用细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内进行离心处理，PBS洗3次，每次进行低速离心处理，弃上清液除去细胞碎片，用细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用；

所述步骤3)中的肾脏组织块与PBS的质量体积比为10-20g/L；

所述步骤4)中的水浴温度为37℃，研磨转速为2000r/min-3000r/min，研磨时间为1-3min；酶解消化时间为1小时-1.5小时。

2.根据权利要求1所述的鱼类单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的PBS试剂、D-Han氏液和IV型胶原酶液的配制具体为：

1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS，pH＝7.2：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24gKH₂PO₄，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用；

1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na₂HPO₄·H₂O 0.06g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃ 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节pH值至7.2-7.4，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；

1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶，室温25℃搅拌溶解于100mlD-Han氏液，4℃过夜，0.22μm过滤除菌，配制成0.5g/L IV 型胶原酶液。

3.根据权利要求1所述的鱼类单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中用细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内进行离心处理，PBS洗3次，每次进行低速离心处理，弃上清液除去细胞碎片，用细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用，具体为：以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1000/min-1500r/min离心3min-5min，PBS洗3次，每次以500r/min-800r/min低速离心3min-5min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。