[发明专利]一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法

说明书

本发明涉及一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法。本发明人通过在批发酵基础上在适当的时机补加底物的方式，进行多批次地、瞬间地底物补加，使得胞内代谢物产生动态响应，部分胞内代谢物浓度出现升高，在该阶段收集发酵细胞，从而高效地制备具有¹³C标记的代谢物标准品，大幅提高标准品的浓度。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体地，本发明涉及一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法。

背景技术

在微生物研究及生产领域，为高效获取的微生物代谢工程改造所需信息，需要对其代谢途径及途径酶的在体(in vivo)动力学特性有全面的了解。然而，现有技术中，如何快速准确测量微生物的胞内代谢物浓度是一个难题，这主要是因为通常情况下胞内微生物代谢物浓度较低，加之微生物提取、回收、加工等处理过程中胞内代谢物会发生损耗、稀释，进一步地加剧了该类检测的难度。

同位素稀释质谱检测法(IDMS)是通过同位素丰度的精确质谱测量和所加入稀释剂的准确称量，求得待测样品中某元素的绝对量，有效地把元素的化学分析转变为同位素测量，因此具有同位素质谱测量的高精度和化学计量的高准确度。在众多的微生物胞内代谢物检测方法之中，IDMS被认为是目前进行胞内代谢物浓度高通量检测精度最高的一种方法。

Wu等在液质联用检测基础上，通过引入同位素稀释质谱检测技术，以¹³C全标葡萄糖培养的酵母细胞抽提物为内标，大大提高了胞内代谢物浓度的检测精度。毕赤酵母由于其具有生长快，培养基成分明确简单的特点，在制备IDMS技术中已被本领域技术人员采用。

由于制作的原材料相对昂贵，制备待检测代谢物对应的¹³C标准品成为IDMS检测的关键。传统制备¹³C全标记标准品的方法是采用批培养的模式获取，但该方法所制备的胞内代谢物浓度通常较低。并且，有些代谢物的¹³C标记的对应标准品甚至无商品化产品，阻碍了这些代谢物的代谢工程研究进程。

综上可见，¹³C胞内中间代谢物标准品的制备成为应用IDMS方法进行胞内代谢物浓度检测的一个瓶颈，如何降低制备¹³C标准品的成本也成为检测者们迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备用于同位素稀释质谱检测的具有¹³C标记的代谢物标准品的方法，所述方法包括：

(1)利用发酵培养基培养细胞，所述的发酵培养基中的碳源是¹³C标记(全标记)的碳源；

(2)当发酵培养基中¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分批补加¹³C标记的碳源；每次补加后，取发酵液，制备IDMS标准品。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的细胞是酵母细胞；较佳地为毕赤酵母细胞。

在另一优选例中，¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分2～10批补加¹³C标记的碳源；更佳地分3～6批(如4、5批)补加¹³C标记的碳源。

在另一优选例中，在首批补加¹³C标记的碳源前(如提前1～4小时)，还包括提高溶氧的步骤；较佳地通过提高转速来提高溶氧；较佳地将转速提高20～40％。

在另一优选例中，首批次补加¹³C标记的碳源后溶氧下降，待溶氧回升时，进行后一批次补加¹³C标记的碳源。