[发明专利]一种同步检测5种西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其应用

说明书

本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，公开了一种同步检测5种西瓜病毒的多重PCR方法，该PCR体系中含有5对特异性引物(SEQ ID NO1～10)，在一个PCR体系中同步对5种病毒进行扩增，得到了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的特异性条带，建立并优化了能同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV的多重RT‑PCR反应体系。检测结果表明优化后的多重RT‑PCR反应体系能对田间样品进行快速、高效地、准确的检测。对监测西瓜上CiLCV等5种常见病毒病在田间的发生情况以及病害流行预测具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，特别是涉及一种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的体系及其应用，利用该体系可通过一次PCR检测5种侵染西瓜的RNA病毒，达到准确、快速、高效检测的目的。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)是葫芦科西瓜属植物，为夏季水果，果肉鲜甜多汁，能降温去暑；种子含油，可作消遣食品；果皮可药用，有清热、利尿、降血压的功效。自1978年以来，世界西瓜生产持续发展，种植面积、总产量和单产均有大幅提高。据联合国粮食与农业组织统计数据库(FAOSTAT)2013年的数据，全世界共有117个国家种植西瓜，西瓜的种植总面积和产量分别为348.921万公顷和10927.87万吨,位列水果的第7位和第1位；我国是最大的西瓜生产国，2013年种植面积和产量分别为183.98万公顷和7318.88万吨，占全世界52.73％和66.97％。

随着西瓜种植面积的不断扩大，种植区气候和耕作制度的变化，西瓜病毒病的发生呈现逐年上升趋势，重病田发病率约为30～50％,甚至高达85％，严重影响了西瓜的产量、品质以及农民的种植积极性。目前在我国能够引起西瓜病毒病害的主要病原有：马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)，烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus,TMV)，马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的甜瓜蚜传黄化病毒(Melonaphid-borne yellows virus,MABYV)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)的南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)以及丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)的西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)。在自然条件下，西瓜植株受到2种或2种以上病毒复合侵染的情况非常普遍，往往会导致病害症状复杂，难以识别病原种类，给病害早期诊断、监测预警和田间有效防控带来极大的困难。2015和2016年在河南开封西瓜田发生了严重的病毒病害，经小RNA深度测序和PCR鉴定发现存在CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV 5种病毒单一或两种以上病毒不同组合的复合侵染型，最多5种病毒可以同时侵染一株西瓜苗。但由于小RNA深度测序成本昂贵，且需要较高的生物信息学分析技能，难以大规模应用于生产实践。因此生产上急需一种快速、准确、简单、易操作的方法同时鉴别多种病毒病原。