[发明专利]燕麦光周期相关基因OPpdi的分子克隆及其功能验证

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及一个燕麦基因OPpdi(a Oat Photoperiod insensitive gene)的克隆及其功能验证，具体涉及的燕麦OPpdi基因克隆、生物信息学分析及转基因拟南芥在光周期方面的分析与功能验证。

背景技术

燕麦(Avena sativa L.)是禾本科(Granmineae)燕麦属(Avena)一年生植物，广泛分布于世界各地42个国家。一般分为皮燕麦和裸燕麦两种，我国主要种植裸燕麦，主要用作粮食食用，茎和叶作为牲畜饲料，所以裸燕麦是我国重要的粮草兼用型作物，具有极高的营养价值和较强的抗逆性，适用性较强，耐严寒、干旱、瘠薄及适度盐碱，种植风险小。燕麦是典型的长日照作物，必须经过长日照阶段才能正常开花结实，但是在短日照条件下会延迟抽穗甚至无法抽穗开花，这一特性不仅使其在地理分布和播种时间上受到限制，甚至导致产量下降^[1-2]。如需在原有遗传资源基础上培育新品种，必须通过传统育种手段引入新的遗传资源，然而由于各地的光照、温度、地理环境和气候条件差异很大，所以引种工作受到很大的限制^[3]，因此深入研究燕麦光周期的分子作用机制，利用分子育种有针对性的调节燕麦光周期反应，使其成为光周期迟钝型，提高适应性，可能有效地扩大引种和种植范围。

许多光周期诱导开花的基因已被报道，PRR(pseudo-response regulator)是其中一类调控光周期的蛋白家族，进化保守，它们蛋白质的C端都包含一个CCT区域，含有CCT区域的基因在DNA水平上非常保守，都在植物感受日照长度的开花调控中起着非常重要的作用。CCT区域也是开花调控关键因子CO(CONSTANS)家族蛋白的保守区^[4]。小麦的光周期反应主要受到小麦2D、2B和2A染色体短臂上的Photoperiod 1(PPD)位点，分别称Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1^[5-6]。小麦PPD 1基因上游片段缺失会降低光周期的敏感性^[7]。光钝基因Ppd-D1a在编码序列上游区域缺失2089bp核苷酸，改变了基因的表达模式及下游基因CO(CONSTANS)和FT(FLOWERINGLOCUST)的表达，在小麦表型上呈现出，无论在长日或短日照条件下均提前开花^[8-9]。光周期基因Ppd-Dla已经被应用于小麦育种，使得小麦获得更广泛的适应性^[10]。Ppd-B1也对小麦抽穗有影响，在Ppd-Dla遗传背景下，Ppd-B1a比Ppd-B1b小麦的抽穗期提前6.7day^[11-12]。Ppd-B1位点拷贝数的多样性也会对小麦开花性状产生影响，导致小麦出现早花性状^[13]。不仅Ppd基因对小麦光周期反应会产生影响，在普通小麦中与Ppd-1同源的基因TaPRR73，该基因在转基因水稻中高水平表达时促进水稻在长日照条件下早开花^[14]。

利用比较遗传学和图位克隆法在二倍体大麦中获得两个控制光周期反应的重要位点。第一个是位于2H染色体短臂上的Ppd-H1，与拟南芥生物钟Pseudo-response regulator基因同源^[15]。Ppd-H1基因普遍存在于冬大麦中，在长日照条件下通过上调HvFT1基因(与拟南芥中的FT基因同源)的表达量促进早开花^[15,16]，但是Ppd-H1基因在保守的CCT区域发生突变后，在长日照条件下开花延迟，这种表型变化在春季小麦的种植区域中表现的尤为显著^[15,17-19]。第二个位点是位于1H染色体长臂的Ppd-H2，它控制短日照下开花，光敏感等位基因在短日照下延迟开花^[20]。