[发明专利]一种ampC基因的实时荧光定量PCR快速检测系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种ampC基因的实时PCR快速检测系统，属于实时PCR应用技术领域。

背景技术

耐药菌的危害已遍及全球，耐药性问题成为世界性的新的研究热点。自从第一个抗生素——青霉素发现以来，人类研制、开发了多种抗菌药物，成功地控制和治疗了由细菌引起的感染性疾病。然而，随着抗生素的不断应用，细菌的耐药性问题越来越突出，越来越严重。2000年6月12日路透社报道世界卫生组织的观点：假若人们继续滥用抗生素，对一切药物产生抵抗的“超级细菌”将把人类带回到旧时代，一些小小的感染也会使人丧命。耐药菌产生之快、传播之迅速、耐药率之高引起世界性广泛关注。耐药菌的危害十分严重，它不仅使药物疗效减弱，药物剂量极大，疗程延长，复发率升高，治疗费用增加，有时还引起并发症，某些情况下甚至会使抗生素失去疗效导致病人死亡率升高。细菌耐药性的出现和耐药细菌的感染常使经验型治疗难以奏效，给临床抗感染治疗带来极大的挑战。因此，及时准确地检测细菌的耐药性，对细菌耐药性的变迁和某些重点的耐药细菌进行长期的监测和分析，可为临床抗感染治疗方案的拟定提供有益帮助。

在临床病原菌的各种耐药问题中，以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺类抗生素的耐药问题尤其突出，给临床治疗感染性疾病带来极大困难。β- 内酰胺类抗生素是现有的抗生素中使用最广泛的一类，它系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类。β-内酰胺类抗生素通过抑制细菌胞壁的粘肽合成酶，阻碍细胞壁的合成而起到杀菌作用。针对β-内酰胺类抗生素，细菌在进化与繁殖过程中也产生了一套防卫机制，其中最重要的方式是产生β- 内酰胺酶。β-内酰胺酶可以水解β-内酰胺环中的酰胺键，使之转化成为无活性的衍生物而失去杀菌作用，这是革兰阴性杆菌耐β-内酰胺类抗生素的主要机制。

β-内酰胺酶种类繁多、特性各异，目前已发现的β-内酰胺酶超过300 种，其中头孢菌素酶(AmpC酶)是临床较为常见的β-内酰胺酶，具有重要的检测意义。质粒AmpC酶高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式转移给其它菌种，造成耐药性的广泛传播。目前，在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属中都已发现质粒介导的AmpC酶。质粒AmpC酶危害严重，这是因为一种质粒可同时携带多个耐药基因，使得产 AmpC酶的菌株表现出多重耐药性，而且耐药谱呈现扩大趋势。另一方面，质粒的可传递性，使耐药问题越来越严峻，容易引起医院感染的暴发流行。

要减缓和控制耐药菌株的产生，建立一种可靠的检测方法是关键，而如何快速、准确的检测质粒介导的AmpC酶是目前临床实验室面临的一个普遍难题。目前用于实验研究和临床检测的常见方法主要有以下几种：头孢西丁纸片法、头孢西丁三维试验、等点聚焦电泳/抑制试验和基因检测方法。前三种方法是利用耐药表型筛选法或抑制剂筛选法对AmpC酶进行检测，其缺点是耗时、特异性差、操作繁琐、检测结果易受环境因素影响，所以假阳性率高。基因检测方法可以有效弥补表型检测的缺点，目前使用比较多的是传统PCR 方法和DNA芯片方法。传统PCR方法根据质粒ampC基因的同源性设计群特异性引物，通过PCR对质粒ampC基因进行扩增。但该方法需要对PCR产物进行电泳分析，开管操作易产生气溶胶污染，导致假阳性结果出现。DNA芯片方法通过PCR过程对扩增产物进行标记，若标记的产物与DNA芯片上的探针发生杂交，即可证明有耐药基因的存在。DNA芯片技术虽然在检测通量上有很大优势，但却需要PCR扩增、杂交、洗脱、检测荧光等一系列操作步骤，而且成本高，难以在临床实验室推广。由于上述种种原因，很多临床实验室很难准确及时的检出质粒介导的AmpC酶。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种ampC基因的实时荧光定量PCR快速检测系统，具体涉及质粒ampC基因的检测。本发明可以有效弥补现有检测方法的不足。本发明提供了一种简便、准确的检测质粒ampC基因的快速检测系统。本发明的技术方案如下：

一种ampC基因的实时荧光定量PCR快速检测系统，其中，分子信标探针是一种含有“茎-环”结构，分子信标探针的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；

本发明的特异性引物为：

上游引物F：5’-ATAGTATTGGAATACGTTATTA-3’；

下游引物F：5’-TATGCACTAGAATATGAGTC-3’。