[发明专利]一种低温碱性蛋白酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种低温碱性蛋白酶及其制备方法，其在低温条件下尤其4‑15摄氏度条件下，在平板酶解圈法和荧光显色法测试中均比野生株的碱性蛋白酶具有更好的酶活，具备应用于洗涤产品的前景，且在制备过程中利用了不同的枯草芽孢杆菌的转化方法，提高了转化的效率，较现有的制备方法具有时间短效率高的优点。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和重组技术，尤其是一种低温碱性蛋白酶及其制备方法。

背景技术

蛋白酶是具有水解蛋白质肽键的一类酶的总称，可用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学、工业、废物处理等方面。尤其是碱性蛋白酶因其具有外源表达技术成熟、相对较高的酶活性，在洗涤剂工业领域中有重要应用价值。目前全世界工业用酶制剂中洗涤剂酶约占1/3。近年来国内外洗涤剂工业较具变革性的成果就是使用酶制剂，使洗涤剂朝低磷或无磷化的方向发展，减少环境污染，加酶洗涤剂在洗涤剂中所占的比重越来越大。目前，作为洗涤剂添加剂的碱性蛋白酶多为中温蛋白酶，最适反应温度通常在50～70℃。但洗涤剂在日常生活中，通常在室温28℃甚至更低温度中使用，因此添加到洗涤剂中的碱性蛋白酶的催化效率并不高。蛋白酶制剂在低温条件下更高的酶活性质对于其在节能洗涤行业中的应用有着重要意义。

近年来随着世界洗涤领域发生的根本性改变，全球洗衣正向着低温、节水型发展，以便节约能源，所以要求洗涤剂用酶(主要是碱性蛋白酶)在低温条件下仍然维持相对高的酶活性。温度是影响生化反应的重要因素，温度每下降10℃，生化反应速度将降低2-3倍。中温酶和高温酶的最适反应温度都较高，在低温下反应活性很低。由于低温碱性蛋白酶在低温下具有较高的活性，因此越来越受到关注。传统的作为洗涤剂添加剂的碱性蛋白酶的最适反应温度通常在50～70℃，在低温下的酶活性很低，所表现出的清洁能力已难以满足消费者的需求。如：Savinase 4.0T低温碱性蛋白酶在pH 10条件下，最适反应温度55℃、20℃时相对活性约为15％。Properase CT低温碱性蛋白酶在pH 10条件下，最适反应温度50℃-55℃，20℃时相对活性约为42％。所以，传统的洗涤剂用酶在低温条件下的酶活性已不适应新一代加酶洗涤剂的发展。低温碱性蛋白酶其最适反应温度通常在40℃以下，应用在食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性，因此对中温蛋白酶低温进化是非常必要的。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供了一种在低温条件下酶活高的碱性蛋白酶及其制备方法。

本发明实现目的技术路线如下：

一种低温碱性蛋白酶，具有如下氨基酸序列：

将SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列中的(a)93位、(b)151、(c)217、(d)223位替换为如下氨基酸残基：

在位置(a)：精氨酸，

在位置(b)：精氨酸，

在位置(c)：色氨酸，

在位置(d)：天冬酰胺。

而且，所述的一种低温碱性蛋白酶，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，优选B.subtilisWB800作为表达宿主，或B.subtilis SCK6作为表达宿主，以pBCS为质粒。

而且，所述的一种低温碱性蛋白酶相比于SEQ ID NO.1编码的碱性蛋白酶，在4摄氏度-15摄氏度条件下具有更高的酶活力。

一种低温碱性蛋白酶的制备方法：按照下列步骤进行：

(1)将野生碱性蛋白酶基因与载体相连，得到携带野生碱性蛋白酶基因的重组表达载体；

(2)对携带野生碱性蛋白酶基因的重组表达载体进行定点突变，得到携带低温碱性蛋白酶基因的重组表达载体；

(2)将重组载体转化入宿主菌株中，得到重组细胞；