[发明专利]一种基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法

权利要求书

1.一种基于低温快速成型的软骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液；其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为80000～100000gmol^-1，该步骤中采用的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或四氢呋喃；

(2)在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中氯化钠颗粒与PLGA的质量比为1:2～1:1，氯化钠颗粒的粒径为35～40μm；

(3)将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；

(4)将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体；

(5)去除含有氯化钠颗粒的支架本体中的有机溶剂；

(6)将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡10～48h，待氯化钠溶出后干燥得到基于低温快速成型的软骨组织工程支架；

所述制备方法还包括在步骤(6)之后执行的以下步骤(7)：

将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述基于低温快速成型的软骨组织工程支架上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述基于低温快速成型的软骨组织工程支架的孔隙结构中并覆盖所述基于低温快速成型的软骨组织工程支架表面；

并且，所述水凝胶为聚氨基类水凝胶；所述步骤(7)具体为：

将聚氨基类水凝胶与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成水凝胶溶液，其中聚氨基类水凝胶的质量分数为4％～12％；

将水凝胶溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨 髓间充质干细胞的细胞浓度为5×10⁵～2×10⁶/ml；

将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述基于低温快速成型的软骨组织工程支架上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min离心10～20分钟；取出离心后的基于低温快速成型的软骨组织工程支架置于37℃环境下保存；

所述聚氨基类水凝胶为通过以下方法制备的RGD-PEG-PELG-KGN：

以aPEG-NH₂为大分子引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物aPEG-PELG₁₃；

在aPEG-PELG₁₃的两端分别连接RGD肽以及小分子化合物KGN构成RGD-PEG-PELG-KGN；

其中，制备RGD-PEG-PELG-KGN的步骤具体为：

将aPEG-PELG₁₃溶于DMF中配制浓度为0.1～0.15g/ml的聚氨基酸DMF溶液；再将KGN溶于DMF中配制浓度为0.03～0.04g/ml的KGN溶液，用EDC/NHS活化后在冰水浴中缓慢滴加到聚氨基酸DMF溶液中，其中aPEG-PELG₁₃和KGN的用量比为(4.3～5)：1，搅拌反应2～4h，用截留量为3000的透析袋在水中透析2～4天后冻干得到aPEG-PELG-KGN待用；

将aPEG-PELG-KGN、CRGD和偶氮二异丁腈以(79～82)：(58～62)：(3～4)的质量比溶于DMF溶液中，放入安全瓶中在液氮条件下冻实后用高压油泵抽15～25min，充入氮气保护，融化后再抽15～25min，重复3次以除去其中的氧气，氮气保护加热到65℃搅拌反应3天，用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析2～4天后冻干得到RGD-PEG-PELG-KGN。

2.根据权利要求1所述的基于低温快速成型的软骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，制备聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的步骤具体为：

将aPEG-NH₂与甲苯混合后在120～140℃下共沸除水，抽干甲苯后，按照1:1.2～1:1.8的质量比加入γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐，并溶解于干燥的DMF中在22～26℃且氮气保护条件下反应72～120h，然后用冰乙醚沉降2～4次，并在室温条件下真空干燥后得到aPEG-PELG₁₃。