[发明专利]用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

(1)SLC2A9rs3775948标准品；

(2)引物，包括具有SEQ ID NO.1的上游引物序列和具有SEQ ID NO.2的下游引物序列；

(3)含饱和荧光染料Eva Green的PCR扩增试剂。

2.根据权利要求1所述的用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒，其特征在于，所述SLC2A9rs3775948标准品按照下述方法制备，具体包括如下步骤：

(1)重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs3775948的构建和转化：合成具有SEQ ID NO.3的SLC2A9rs3775948野生型DNA序列和具有SEQ ID NO.4的SLC2A9rs3775948纯合突变型DNA序列；

(2)连接反应：将步骤(1)合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，采用连接体系进行配制，配制完成后置于16℃进行过夜连接反应；连接体系如下：

(3)pMD18-T-rs3775948质粒的转化以及PCR鉴定；

(4)pMD18-T-rs3775948质粒的获取和定量。

3.根据权利要求1所述的用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒，其特征在于，所述步骤(3)pMD18-T-rs3775948质粒的转化以及PCR鉴定具体包括如下步骤：

(3.1)从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻；

(3.2)取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

(3.3)42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min；

(3.4)于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120转轻摇培养90min；

(3.5)将上述培养液短暂离心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

(3.6)从平板上挑取单克隆菌落于500μL Amp抗性LB液体培养基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时；

(3.7)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；

(3.8)用具有SEQ ID NO.1的上游引物序列和具有SEQ ID NO.2的下游引物序列扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化；

(3.9)重组阴性质粒和重组阳性质粒提取：采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时取10ul纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

4.根据权利要求3所述的用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒，其特征在于，所述步骤(3.8)中的PCR体系如下：

PCR扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35个循环；72℃10min。

5.根据权利要求2所述的用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述步骤(4)pMD18-T-rs3775948质粒的获取和定量具体包括如下步骤：

(4.1)将步骤(3.9)得到的冻存的含有重组质粒pMD18-T-rs3775948的大肠杆菌DH5α100μl接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；

(4.2)采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；

(4.3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度，纯度满足A260/A280＝1.76，即可。