[发明专利]一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，具体的涉及一种基于裂盖马鞍菌生物学特性、通过子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定、低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选、总RNA的提取及检测、cDNA的合成及文库构建、原始文库重组率的滴度测定、EST序列分析的方法。

背景技术

裂盖马鞍菌(Helvella leucopus Pers.) 俗名巴楚蘑菇、地木耳，属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌目(Pizizales)、马鞍菌科(Helvellaceae)、马鞍菌属(Helvella)，原产于新疆巴楚县原始胡杨林场，是叶尔羌河水、千年胡杨树、干旱少雨的大漠气候条件经大自然融合孕育出的一种绿色珍稀食用菌，素以纯天然、质嫩味美、营养丰富而著称，它不但具有较高的营养价值，还有提高人体免疫力、促进大脑发育、防止脑动脉硬化、促进副肾皮质激素分泌、增强人体应激能力、溶血栓、降血压、降低胆固醇等多种保健作用，市场上干品价格居高不下仍供不应求。

近年来，由于对裂盖马鞍菌人为过渡采收加之其生长环境不断恶化等原因其产量逐年下降，而人工驯化和栽培至今尚未获实质性突破，急需对裂盖马鞍菌进行区域普查、育种技术及栽培技术进行深入研究。但国内外对裂盖马鞍菌的研究甚少，近年来只有国内学者朱铭莪、孟庆玲、胡建伟等对裂盖马鞍菌的营养成分、免疫功能、抗氧化及抗肿瘤活性、孢子萌发及环境适应性进行了初步研究。因此，为了更好的保护野生裂盖马鞍菌种群及生物遗传多样性和可持续开发利用，急需对离子注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法进行深入研究。

离子束诱变技术是上世纪80年代中期由我国科学家开创的新兴研究领域，是育种方法学的重要创新并从国内走向世界。在离子注入生物效应的研究中，呈现出一些独特性，它主要包括能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷交换这4个原初过程，这4个过程在很短的时间内同时发生，很难区分各自的独立作用。离子注入产生的生物效应的因素与辐射不同，离子注入除了具有能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动量传递产生的级联损伤，表现为遗传物质的原子移位、重排或基因缺失，还有沉积离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。注入的荷能离子的电信号和所形成的微电场影响着生物体生命过程中的基因表达和调控、细胞内外的能量交换、物质运输、信息传递，并刺激损伤DNA 的修复、生物体的生长和发育。因此，离子束诱变技术已成为拥有我国自主知识产权的定向遗传育种的新方法、新途径。

人类对于基因组进化的兴趣最早可以追溯到20世纪70-80年代选择学说和中性学说的逐渐形成和争论。虽然至今还没有完全弄清基因进化的具体过程和机制，但目前已经普遍认为广泛存在的点突变和插入/缺失突变是基因组进化的重要驱动力。自1927年Muller发现X射线能诱发果蝇产生大量多种类型突变和20世纪40年代初Fresjeben和Lein利用诱变剂在植物上获得有益突变以来，突变被广泛应用于生物的遗传育种及定向进化研究。随着DNA高精度高通量快速测序技术的发展和完善，测序成本大幅度降低，促进了全基因组突变技术和方法的发展和应用(Nature Genetics, publish online, 20 june 2007)。较早用于全基因组突变技术TILLING，是将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效的从化学诱变剂（EMS）诱变产生的突变群体中鉴定出点突变。

本申请的发明人经过近年来深入裂盖马鞍菌发生地对当地物候条件、发生基质、发生方式的野外实地考察结合在实验室对其生物学特性、离子束诱变育种方法深入细致的研究，设计了一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，实验业已证实该方法是一种简便实用的裂盖马鞍菌的离子束诱变育种方法。

发明内容

本发明提供了一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，该方法包括子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定、低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选、总RNA的提取及检测、cDNA的合成及文库构建、原始文库重组率的滴度测定、EST序列分析等步骤。优选地，在离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的步骤中还包括离子束注入组合参数的优化、选择性筛选方法的设计和全基因组测序及分析的步骤，经过上述处理可获得裂盖马鞍菌创新突变菌株并揭示全基因组突变及定向进化的分子机制。