[发明专利]一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法

权利要求书

1.一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，其特征在于：（1）子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定：五一期间分赴裂盖马鞍菌发生地叶尔羌流域的巴楚县和塔里木河流域的轮台县林区采集裂盖马鞍菌子实体，并通过就地的酒精表层无菌处理及低温保鲜处理后快速运返实验室然后，从中分别取几片裂盖马鞍菌子实体成熟耳片经1.0KGy的γ射线辐照处理后置于无菌培养皿中收集弹射子囊孢子，然后用无菌水分别洗脱收集的弹射子囊孢子经荧光标记、计数、稀释后分别取 0.2mL子囊孢子悬液一一对应涂布在无菌空白培养皿和水琼脂分离培养基平板上，涂菌的空白培养皿自然风干以备后续离子束注入诱变之用，涂菌的水琼脂分离培养基25℃恒温培养，并镜检水琼脂分离培养基平板上单次生子囊孢子的动态萌发过程，待平板上出现单菌落之后挑取初生菌丝体到 PDA平板培养基上25℃恒温培养，镜检菌丝体的微观形态并动态观察其生长过程；（2）低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选：以分离鉴定的裂盖马鞍菌单次生子囊孢子为靶材，经不同能量、剂量脉冲时间及正交组合的N⁺注入后，用含有多态性DNA的缓冲液对离子注入的涂菌培养皿进行洗脱、复活和培养，并与未经离子束注入的对照对比，考察不同注入能量、剂量、脉冲时间对细胞存活率的影响，并以Loewer等人的“突变累计”方法计算突变率，获得低能离子注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的最佳N⁺注入参数为：注入能量15keV、注入剂量1.0×10¹⁶cm^-2、真空度2.5×10^-3Pa、脉冲时间5s/次，然后，挑取PDA平板培养基上单菌落初生菌丝体分别转接到CMC平板培养基和氨基酸及维生素缺陷型平板培养基上25℃恒温培养，通过测定透明圈直径和营养缺陷型选择性筛选方法筛选裂盖马鞍菌创新突变菌株，其中，营养缺陷型平板培养基是在质量百分比为1.0%玉米淀粉、2.0%葡萄糖、0.2%磷酸二氢钾、0.15%硫酸镁、2.0%琼脂、pH自然的基础平板培养基上分别添加0.2mL质量百分比为70ppm的天门冬氨酸Asp、70ppm亮氨酸Leu、50ppm丝氨酸Ser、70ppm异亮氨酸Ile、90ppm谷氨酸Glu、90ppm酪氨酸Tyr、60ppm脯氨酸Pro、80ppm苯丙氨酸Phe、40ppm甘氨酸Gly、70ppm赖氨酸Lys、40ppm丙氨酸Ala、100ppm色氨酸Trp、80ppm组氨酸His、120ppm胱氨酸Cys、20ppm精氨酸Arg、60ppm缬氨酸Va、60ppm苏氨酸Thr、70ppm蛋氨酸Met、100ppm维生素B1、100ppm维生素B2、100ppm维生素B6溶液，本方法所用的多态性DNA片段包括12种单链小分子DNA及以其为模板经PCR扩增获得的双链小分子DNA，12种单链小分子DNA序列如下（N表示任意相同碱基）：5^、ATGCNNNNNNNNNNNNNNNN3^、、5^、ATCGNNNNNNNNNNNNNNNN3^、、5^、AGCTNNNNNNNNNNNNNNNN3^、、5^、AGTCNNNNNNNNNNNNNNNN3^、、5^、ACTGNNNNNNNNNNNNNNNN3^、、5^、ACGTNNNNNNNNNNNNNNNN3^、、3^、ATGCNNNNNNNNNNNNNNNN5^、、3^、ATCGNNNNNNNNNNNNNNNN5^、、3^、AGCTNNNNNNNNNNNNNNNN5^、、3^、AGTCNNNNNNNNNNNNNNNN5^、、3^、ACTGNNNNNNNNNNNNNNNN5^、、3^、ACGTNNNNNNNNNNNNNNNN5^、；（3）总RNA的提取及检测：将裂盖马鞍菌野生型和突变菌株菌丝体接种到 PDA 平板培养基上，置于 25℃培养箱中培养 10 d，取适量初生菌丝体立即冻存于液氮中，在液氮中研细转至匀浆管中，加入1mL RNA-solv Reagent试剂，按北京华越洋生物科技有限公司RNA试剂盒说明书操作提取总RNA，然后，自然干燥后溶于0.1 mL无RNase的H₂O中，用紫外分光光度计测量所提RNA的纯度(OD260／OD280)，用质量分数为1.2％的琼脂糖电泳检测所提RNA的完整性；（4）cDNA的合成及文库构建：取2 µg mRNA在M-MLV反转录酶的作用下，42℃温浴l h，合成cDNA第一链，取2 µL单链cDNA通过LD-PCR法合成第二链，所用程序为95℃ l min预变性，95℃ 15s，24个循环，68℃延伸6 min，所有的第二链产物经过蛋白酶K及Sfi I限制性内切酶消化后用Chroma SPIN-400凝胶柱将cDNA片段按分子大小分布，收集大于500 bp的片段经乙醇沉淀后重新溶于7µL去离子水中，最后，将片段连入pDNR-LIB载体，其中，CDS III／3'-PCR引物：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'，SMART IV低聚核苷酸：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCTTACGGCCGGG-3'，第二链合成所用引物：5'-PCR引物：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，3'-PCR引物：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'；（5）原始文库重组率的滴度测定：于氯霉素抗性培养基上任意挑取24个重组子，通过质粒酶切，电泳检测得到文库重组率，其中，重组率=(有插入片段的反应个数／反应总数)×100％；（6）EST序列分析：利用Solexa高通量测序技术对不同文库进行测序，将所得序列去除大肠杆菌DNA序列、载体序列、接头序列和短于100 bp的序列，并将所得序列应用CAP3序列软件进行拼接，参数设定标准是2个片段至少100 bp范围内有大于95％的一致性序列，处理后的EST序列与本地化的GMGI(Glyeine Max Gene Index，Release 16)、AGI(Arabidopsis Gene Index，Release 12)和OGI(Oryza Sativa Gene Index，Release 16)基因数据库进行Blast N分析，E值设定为E-value<10^-15，根据功能注释信息和GI号，采用国际标准基因分类体系(Gene Ontology，GO)进行分类，获得裂盖马鞍菌基因突变的位点并揭示其全基因组突变及定向进化的分子机制。