[发明专利]一种烯键还原酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种烯键还原酶以及制备方法和应用，本发明提供的烯键还原酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，由碱基序列如SEQ ID No.1所示烯键还原酶基因编码。本发明公开该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原共轭C＝C双键以制备光学活性的带吸电子基团饱和化合物中的应用。本发明提供的重组酶的制备方法简单，可作为催化剂应用于共轭C＝C双键的不对称还原，适用的化合物范围广，具有优异的催化活性，可获得高转化率、高光学纯度的带吸电子基团饱和化合物，且反应条件温和、对环境友好，具有很好的工业应用开发前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种烯键还原酶，及其制备方法和应用。

背景技术

在生物催化领域，高效催化的酶对催化反应的进行是至关重要的。烯键还原酶(enoate reductases，ERs)作为一类受到广泛关注的新型酶，能够高选择性地还原碳碳双键，近年来对其高效催化酶源的研究成为热点。带有吸电子基团的饱和化合物是医药、激素、香料、以及农药生产等方面的重要物质，常常需要由其α,β-不饱和化合物选择性还原获得，但吸电子基团易使烯烃钝化，对其进行选择性还原是一个富有挑战性的课题。化学合成中最常用过渡金属及其络合物对该类化合物还原，此法存在成本高，条件苛刻，产率低、会污染环境等缺点。研究表明，生物界中的烯键还原酶能够还原碳碳双键，且选择性高，产率好，条件温和，是一条环境友好的合成途径。目前对于能够进行高效催化的烯键还原酶种类研究还很少，几乎没有可以用于工业生产应用的。

在工业上，红球菌属是一个非常具有商业价值的细菌类群，许多菌株参与了氨基酸如L2亮氨酸和L2苯丙氨酸的生产以及固醇类的转化。目前红球菌的研究主要集中在腈水解酶应用上，应用范围窄。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可用于工业生产应用的烯键还原酶，包含所述烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体或烯键还原酶重组表达转化体；本发明另一目的是提供一种制备重组烯键还原酶的方法；本发明还提供一种将烯键还原酶或重组烯键还原酶应用于烯键的还原，例如α,β-不饱和化合物中C＝C双键的还原，特别是α,β-不饱和化合物中C＝C双键的不对称还原。

为了实现本发明的目的，

一方面，本发明提供一种烯键还原酶基因，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

所述烯键还原酶基因制备步骤如下：通过引物，以紫红色红球菌Rhodococcusrhodochrous ATCC 17895的基因组为模板，经聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增得碱基序列如SEQ ID No.1所示的烯键还原酶基因。

一方面，本发明提供一种本发明所述的烯键还原酶基因编码的烯键还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，本发明所述的烯键还原酶，所述的烯键还原酶的GenBank登录号为：KT321320，下文也简称烯键还原酶为RhER 2718，其来源于紫红色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC 17895。

另一方面，本发明提供一种包含碱基序列如SEQ ID No.1所示的烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体。

所述烯键还原酶重组表达载体的制备方法如下：将碱基序列如SEQ ID No.1所示的烯键还原酶基因通过酶切后连接于载体上，即可。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a(+)。

较佳的，可通过下述方法制得本发明的烯键还原酶重组表达载体：将碱基序列如SEQ ID No.1所示的烯键还原酶基因和质粒pET28a(+)用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，即可得本发明的烯键还原酶重组表达载体。

进一步地，本发明所述的烯键还原酶重组表达载体，其骨架为pET28a(+)。