[发明专利]一种高效扩增NK细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，尤其涉及一种高效扩增NK细胞的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK cell)是T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，是人体免疫系统的第一道防线，在机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫中起重要作用。NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞。同时，还可以产生一系列的细胞因子进而对机体的获得性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和特异性免疫的桥梁。NK细胞由于具有直接杀伤活性和免疫调节活性，而一度成为免疫细胞过继疗法的新热点。此外，还有越来越多的报道将原代NK细胞或NK细胞系进行基因改造以提高其杀伤肿瘤细胞的特异性和活性，进而进行过继免疫治疗，在动物实验和临床试验中均取得了良好的效果。可见，NK细胞在肿瘤的生物治疗中具有广阔的应用前景。

NK细胞的杀伤功能及疗效与其数量直接相关，然而NK细胞在外周血中比例小，约占外周血PBMC的5％～10％，传统的使用的野生型IL-2扩增NK细胞的方案，不仅NK扩增倍数有限，端粒酶活性降低，而且扩增后NK细胞的各种活化受体或CD16分子表达丢失导致NK细胞毒性减弱；最近的研究发现，野生型IL-2还可以扩增Treg细胞，而Treg细胞能够显著抑制NK细胞的杀伤作用，从而影响NK细胞的临床疗效。尽管国外已有商品化的NK细胞分离试剂盒，利用这些试剂，通过FACS分选或MACS法纯化可获得90％以上纯度的NK细胞。但操作复杂，费用昂贵，且高度纯化的NK细胞不能在体外大量扩增，难以满足临床试验的需求。之前有文献报道，采用K562细胞转染跨膜IL-21和CD137复合体与体外PBMC共培养扩增NK细胞，使得NK细胞数量、纯度和活性显著增强。然而，肿瘤微环境是一个复杂的综合系统，在肿瘤微环境中存在有大量的肿瘤相关巨噬细胞和CD19+B细胞，这些细胞为肿瘤细胞的生长提供营养因子。用仅转染跨膜IL-21和CD137复合体的K562细胞激活扩增NK细胞虽然对肿瘤细胞有很强的杀伤能力，但是对肿瘤微环境中的肿瘤细胞相关巨噬细胞和B细胞的杀伤能力却很弱。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用人IL-2突变体联合K562细胞高效扩增NK细胞的方法。该方法操作简单，扩增的NK细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于NK细胞大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。

本发明的一种利用人IL-2突变体联合K562细胞高效扩增NK细胞的方法，包括：

(1)使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同时转染K562细胞；载体中含有病毒启动子和选择标记基因；

(2)当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，体外培养K562细胞一段时间后，经流式细胞术分选，获得稳定表达跨膜蛋白CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞；

(3)将稳定表达CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞经过γ射线照射灭活，作为NK细胞的滋养细胞；

(4)分离并提取外周血单个核细胞(即PBMC)并计数，按一定的比例(K562:PBMC)加入灭活的K562滋养细胞，在IL-2突变体协同作用下，与PBMC共培养2～3周，即可得到纯度较高的NK细胞。

其中，步骤(1)所述的CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接IL-21基因后使得IL-21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64为膜蛋白。

步骤(2)所述的纯化后的K562工程细胞其跨膜CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的表达量在85％以上。

步骤(3)所述的灭活K562工程细胞的γ射线剂量为100Gy，辐照时间为20～30min。

步骤(4)所述的IL-2突变体是通过对氨基酸定点替代，将其IL2α受体结合点突变，突变的位点在IL-2的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位点。不仅能够其降低诱导调节性T细胞的功能，同时还保留了其对NK细胞的免疫活性，可用于刺激免疫系统，从而提高其临床疗效和应用范围。