[发明专利]K亚群禽白血病病毒荧光定量RT‑PCR检测引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。

背景技术

禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALVs)是反转录病毒科、肿瘤病毒亚科的一员，该病毒群引起的所有良性和恶性肿瘤统称为禽白血病(avian leukosis,AL)。(殷震，1997)。禽白血病被列为2012-2020年国家优先防治的动物疫病之一(高鸿宾，2012)。禽白血病病毒诱发的肿瘤主要包括白血病、结缔组织肿瘤、上皮性肿瘤、内皮性肿瘤及其他相关肿瘤，其中白血病又可分为淋巴细胞性白血病(Lymphoid Leucosis,LL)、成红细胞性白血病(Erythroblastosis,EB)、成髓细胞性白血病(Myeloblastosis,MB)和髓细胞性白血病(Myelocytomatosis,ML)(Purchase et al.,1984；霍夫斯塔，1980)。

目前，病毒分离鉴定是检测禽白血病病毒最常规基础的方法，主要是测定病毒或病毒抗原，准确性较高、易操作。其缺点在于耗时长，从采样到检出结果至少需要10天时间；存在假阳性或病毒隐性未检出的可能性；花费高；操作流程繁琐。因此，该方法不适用于大范围、多样品的检测，难以在临床中推广和应用。病毒中和试验是检测禽白血病病毒最灵敏的方法之一。但存在操作步骤繁琐，耗时耗力，花费高等缺点，临床实际检测中很少用到。琼脂扩散试验是哈尔滨兽研所在20世纪80年代建立的方法。该方法需要拔羽取髓，会引起鸡群较大的应激反应，同时特异性也较低，会受内源性病毒的干扰，出现一定的假阳性。(关云涛等，2002)。IFA的基本原理是根据抗原-抗体反应，将荧光色素标记在已知抗体(或抗原)上，当其与对应的抗原(或抗体)结合后，就能够在荧光显微镜下观察到特异性的荧光信号。IFA的主要特点是特异性强，反应速度快，结果易观察，但是，操作步骤繁琐，专业要求高，耗时长，敏感度低，会因非特异染色而出现假阳性，在临床上推广范围较窄。

近几年来，禽白血病发生频繁，给我国农业经济的发展带来很大冲击。经典外源性的禽白血病病毒亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J在检测、净化等方面已经相对成熟，而对于在2008年才发现命名的ALV-K亚群，在相关方面的研究非常滞后。因此，建立一种快速有效的针对ALV-K的检测方法就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、简单快速的K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针，其是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。

作为优选的，所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。

所述引物对和探针的核苷酸序列如下所示：

ALV-F：5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’(SEQ ID NO.1)，

ALV-R：5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’(SEQ ID NO.2)，

ALV-Pb：5’-CCATGTTAGCACCCAACCACACAGAA-3’(SEQ ID NO.3)。

一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其含有如上所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针。

一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中病毒RNA；

(2)利用权利要求1-3任一项所述的引物对和探针对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增；

(3)收集荧光信号，对比标准曲线，计算得到病毒拷贝数。

RT-PCR扩增反应的条件为：42℃5min，95℃0.1min，95℃0.05min，60℃0.34min，共40个循环。

本发明的有益效果是：