[发明专利]艰难梭菌检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种艰难梭菌检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。

背景技术

艰难梭菌（clostridium difficile）是一种专性厌氧革兰氏阳性芽孢梭菌，一般认为是环境和人类肠道中的正常菌群。长期应用抗生素、免疫抑制剂或化疗药物使耐药的艰难梭菌产毒株过度繁殖并释放毒素是导致艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的主要因素。艰难梭菌致病主要因为产生A、B和二元毒素（CDT）。毒素Ａ又称肠毒素导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素Ｂ又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素Ｂ的毒力较毒素Ａ强10倍。大多数产毒株同时产生A和B两种毒素。艰难梭菌在人群中通过粪-口途径传播，主要造成胃肠道感染，轻则引起无症状携带，重则导致严重腹泻、伪膜性肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔甚至死亡。目前，艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）不但是欧美国家最常见的医疗保健机构相关性感染，而且正威胁着全球的公共卫生安全。

目前常用的艰难梭菌快速检测方法主要有以下几种：1）细胞毒性试验（CCTA）：细胞毒性试验是检测因毒素A和B引起的细胞病变，但它需要细胞培养及显微镜观察的相应设施和技术，并且耗时长；2）酶联免疫法（EIA）检测毒素A/B：该方法的特异性高，能区分产毒株和不产毒株，并且检测周期短，数小时即可出结果，目前已有Meridian Premier , TechLab Tox A/B Quik Chek, TeehLab ToxA/B II等多种商品化试剂盒投入使用，但该方法的缺点是灵敏度不够，且不能得到菌株用于分子分型等进一步研究；3）酶联免疫法（EIA）检测谷氨酸脱氢酶（GDH）：GDH是一种存在于艰难梭菌细胞壁抗原性蛋白，它比EIA检测毒素A/B更加灵敏，但该方法特异性较低；4）PCR检测：实时PCR检测技术具有灵敏度高、特异性高等特点，且该方法3h即可获知结果，使用方法简单。

生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术，按照检测对象分为蛋白质芯片和基因芯片。基因芯片利用的是核苷酸链之间的互补作用，特异性强，重现性好，直接针对病原体基因进行，结果更准确，且还具有检测通量大而所需样本量少等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的艰难梭菌检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。

本发明实现其目的的技术方案为：一种艰难梭菌检测并联探针，包括探针1、2、3、4、5，序列分别为SEQ ID NO.1~5。

一种艰难梭菌检测基因芯片，包括固体相和上述的探针组。

作为优选地，上述固相载体为氨基修饰的玻璃基片。

一种艰难梭菌检测试剂盒，包括上述的基因芯片。

在上述艰难梭菌检测试剂盒中，还包括艰难梭菌靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。

作为优选地，所述引物对的下游引物的5’端含有CY3荧光染料标记。

作为优选地，上述艰难梭菌检测试剂盒，还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、洗涤液、艰难梭菌菌液阳性对照样本、人DNA TAE溶液空白对照样本。

在上述技术方案中，PCR反应体系包括：50~150ng/μL的扩增模板 0.4μL，Premix Taq 5μL，浓度为8~12μM的上、下游引物各0.2μL。

一种艰难梭菌的检测方法，使用前述的艰难梭菌检测试剂盒进行检测，当5个检测探针中的3个及以上探针显示的结果为阳性时可以判断样品感染艰难梭菌；当5个检测探针中低于3个探针显示的检测结果为阳性，无法判断该样品是否感染艰难梭菌，应当使用重复测试或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。

作为优选地，PCR扩增反应程序为95℃ 5min；95℃10s、55℃ 30s、72℃30s、30个循环；72℃ 10min。

本发明的有益效果是：设计5条高特异性的探针，当5个检测探针中的3个及以上探针显示的结果为阳性时才判断该项指标为阳性，能极大的提高产品的准确性和精确性，减少其它方法容易出现的假阳性问题；本发明通过 PCR 技术对病原体基因组进行扩增，检测的特异性高，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过CY3荧光染料标记，直观的表现检测结果，检测艰难梭菌与常规方法相比较，检测快速、结果准确、操作简单。

附图说明