[发明专利]一种赤灵芝菌株鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及食用菌种质鉴定技术领域，尤其涉及一种赤灵芝菌株鉴定方法。

背景技术

灵芝在分类系统上隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)、层担子菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)、非褶菌目(Aphyllophorales)、灵芝菌科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)。赤灵芝学名为(Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)。

对于赤灵芝菌种的鉴定，传统的鉴定方法主要是依赖于形态学观察，包括对灵芝子实体的形、色、气、味、质地等外观形状观察等。该方法简便易行，但主观性强，准确性完全依赖于检测者的经验判断。

从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。后来出现了基于DNA序列的分子标记技术，常用的DNA分子标记技术包括RFLP、RADP、SSR、ISSR、AFLP等。DNA的分子标记技术可以弥补和克服传统鉴定方法的一些缺陷，在赤灵芝菌种的鉴定中也取得了良好的应用效果。

但是，现有的分子标记技术主要集中对特征序列的扩增及测序，而利用特征序列仅可以确定灵芝的种属。然而由于属于同一物种，当面对需要对赤灵芝的不同菌种进行鉴定时，现有的分子标记技术并不能满足需求。因此，进一步开发能够用于赤灵芝不同菌株的鉴定方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种赤灵芝菌株鉴定方法。利用存在于ITS1序列中的SNP位点，本发明提供的方法能够将赤灵芝菌种203与其他菌种区分，准确率可达100％。

本发明提供了ITS1序列的SNP位点在赤灵芝菌株鉴定中的应用；

ITS1序列的SNP位点位于ITS1序列5’端的第180位核苷酸。

本发明中，赤灵芝菌株为赤灵芝203。

本发明中，ITS1序列5’端的第180位核苷酸为T则所述赤灵芝菌株为赤灵芝203。

本发明中，利用ITS1序列SNP位点能够区分的赤灵芝菌株为赤灵芝203(Ganoderma lucidum 203)，东北赤灵芝(Ganoderma lucidum DB)，金寨乔康赤灵芝(Ganoderma lucidum JQ)，日本赤灵芝(Ganoderma lucidum RB)。

ITS序列是内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。本发明的通过提取赤灵芝菌种及其制品的DNA，对ITS全长序列进行扩增及测序，将测序得到的ITS序列依据隐马尔科夫模型(Hidden Markov Models)使用HMMER suite软件进行比对注释，得到ITS1序列全长。将注释得到的ITS1序列在本地用DNAMAN软件比对。如果该ITS1序列从5’端开始的第180位为T则为赤灵芝菌种203，如果为C则不是该菌株。经分析，赤灵芝203菌种ITS1序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组。

本发明提供的引物组能够对ITS序列进行全长扩增。然后通过分析其中ITS1序列中的SNP位点，从而实现对赤灵芝203菌种的鉴定。

所述引物组的退火温度为54℃。

本发明提供的引物组在制备鉴定赤灵芝菌株的产品中的应用。

本发明还提供了一种鉴定赤灵芝菌株的试剂盒，包括由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组。

本发明提供的试剂盒还包括PCR反应试剂。

所述PCR反应试剂包括Taq酶，dNTP，Mg²⁺、扩增缓冲液、ddH₂O。

所述PCR反应试剂可混合，也可为混合试剂。优选为混合试剂。更优选，混合试剂中还包括DNA染色剂。优选的，DNA染色剂为Loading Dye。

本发明还提供了一种鉴定赤灵芝菌株的方法，以由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组对待测样品的DNA进行扩增，根据扩增所得片段的SNP位点判断赤灵芝的菌株种类；