[发明专利]一种角膜缘干细胞培养基及其培养方法

说明书

本发明公开了一种角膜缘干细胞培养基及其培养方法，培养基组分为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、5～10ug/ml胰岛素、1～5x10^‑9M 3‑碘甲状腺原氨酸、0.2～1ug/ml氢化可的松、10～20ng/ml霍乱毒素、10～15%胎牛血清、余量为DMEM和/或DMEM/F12；采用I型胶原蛋白作为角膜缘干细胞生长的基底物质对培养板等材料做涂层处理，提高角膜缘干细胞的纯度及稳定性，采用本发明提供的培养基分离角膜缘干细胞，细胞中p63、Pax6抗体阳性率为96%～100%。建立了一种无滋养层、无载体的角膜缘干细胞培养方法，为角膜缘干细胞特异性机制研究和移植治疗提供了稳定的细胞来源。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，更具体地，涉及一种角膜缘干细胞培养基及其培养方法。

背景技术

角膜缘干细胞为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜的鉴别的标志是Bowman氏膜的终止处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，角膜缘干细胞宽约1～2mm，此处仅有上皮层和基质层，其上皮细胞层含10层细胞，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染。其深部基质细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行，在基底部乳头形成，形成特殊的“栅栏”样上皮结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。角膜上皮为有序排列的单层非角质化细胞，角膜上皮细胞的更新来源于角膜缘干细胞(LSCs)，对角膜透明、视力的维持起重要作用。更新过程进行时，角膜缘干细胞向角膜中央迁移，并进行分化，这一完整的过程大概需要14天。LSCs缺乏是世界性、灾难性的眼科疑难病症，严重威胁人类视觉质量，目前缺乏有效治疗手段。常见原因包括眼外伤、碱烧伤和免疫性眼病等，在临床上，表现为角膜不透明化及视觉缺失；眼科检查以角膜上结膜化、出现新生血管、瘢痕及睑球粘连形成为诊断标准。

对于角膜缘干细胞缺乏传统的治疗手段包括羊膜移植和LSCs移植，但羊膜移植可导致角膜上皮表型改变，而传统的LSCs移植需要组织多、医源性损伤较大，临床治疗效果均不理想。自体角膜缘组织移植不适合双眼角膜缘病变的患者。异体角膜缘组织移植存在排斥反应。因此，采用体外培养的角膜缘干细胞移植联合穿透性角膜移植治疗严重的角膜病变，近年来成为人们关注的热点。

对于角膜缘干细胞的培养，目前方法主要采用多种不同的基底层如鼠源NIH 373滋养层、人源羊膜、纤维蛋白胶、Myogel、等离子聚合物涂层、人重组胶原基底物等对角膜缘干细胞进行培养。这些方法都能获得上皮植片，并成功用于干细胞缺乏的补充用以治疗眼表疾病。

现有角膜缘干细胞的培养方法虽能获得上皮细胞，但由于NIH 373细胞为外生非人源细胞，容易引起免疫反应及鼠源衍生病原体的传播；而人源羊膜由于难以获得，耗费大，需要进一步检测是否含有HIV，肝炎病毒等，且存在不透明，具有一定厚度的缺点，容易与角膜基质整合，对角膜厚度和结构有一定影响。上述因素都会影响培养得到的角膜缘干细胞在移植后眼部对光及视觉灵敏度，且现有方法只能用于角膜缘干细胞的一次性使用，无法对角膜缘干细胞进行稳定分离及培养。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种新型的角膜缘干细胞的培养基。

本发明的第二个目的是提供一种角膜缘干细胞的培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种角膜缘干细胞培养基，培养基中含有以下组分：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、5～10ug/ml胰岛素、1～5x10^-9M 3-碘甲状腺原氨酸、0.2～1ug/ml氢化可的松、10～20ng/ml霍乱毒素、10～15％胎牛血清、余量为DMEM和/或DMEM/F12。