[发明专利]一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用，包括如下步骤：(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增FabA基因的上游片段UFabA和下游片段DFabA；(2)将上游片段UFabA和下游片段DFabA与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。本发明提供了裂殖壶菌敲除基因的工程菌的构建方法构，建了敲除FabA基因裂殖壶菌重组菌，该工程菌产多不饱和脂肪酸的能力比出发菌株中所占总油脂的比例减少了26％，而饱和脂肪酸的生产量增加16％。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用。

背景技术

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，指一类18-22碳，包含两个或两个以上不饱和双键的直链脂肪酸，在生物细胞中发挥重要作用，例如，作为细胞膜重要组分，储存油脂，信号传导等功能。目前，PUFAs被分为n-6(或ω-6)和n-3(或ω-3)族两类。在这两类脂肪酸中，n-3族多不饱和脂肪酸包括亚麻酸(α-Linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)，n-6族多不饱和脂肪酸以花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)和亚麻油酸(Gamma-Linolenic Acid，GLA)为主。多不饱和脂肪酸，尤其是n-3族，作为生物活性物质，是促进人类健康和动物生长必要营养物质。

裂殖壶菌是多不饱和脂肪酸的重要生产菌株，目前已被工业化生产DHA，其细胞油脂含量高，生长繁殖快，更耐受机械搅拌，适宜发酵罐大规模培养，并已被美国及欧洲有关食品权利机构批准添加至相关食物中使用(Regulation(EC)No 258/97 of EuropeanParliament，2010)。已经证明，裂殖壶菌具有PUFA合成酶途径(类PKS途径)大量合成多不饱和脂肪酸的能力(Science，2001，293(5528)：290-293；生物工程学报，2010，26(9)：1225-1231；Progress in lipid research，2014，56：19-35)，但是其PKS基因簇合成和调控多不饱和脂肪酸的机理仍然未有明确解释。

羟基脂酰基ACP脱氢异构酶(beta-hydroxydecanoyl-acyl carrier protein(ACP)-dehydratase，FabA)在植物、动物和微生物中广泛分布，与不饱和脂肪酸合成代谢密切相关的酶。FabA基因编码有双功能的3-羟基脂酰ACP脱水异构酶，其异构产物能被FabB基因编码的3-酮基脂酰ACP合成酶I延伸，合成不饱和脂肪酸。该途径被认为是缺氧条件下不饱和脂肪酸合成的经典途径。该脱氢酶基因是多不饱和脂肪酸合成的关键基因之一，裂殖壶菌的PKS基因簇中包含多个脱氢酶(FabA)序列，FabA基因参与了多不饱和脂肪酸合成过程，然而其作用机制目前仍然不清楚。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法。

本发明的另一目的在于提供上述构建的裂殖壶菌工程菌的应用。

本发明的技术方案如下：

一种脱氢异构酶(FabA)基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增FabA基因的上游片段UFabA和下游片段DFabA，上述上游引物对包括上游正向引物和上游反向引物，分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示，下游引物对包括下游正向引物和下游反向引物，分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示；