[发明专利]一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）以裂殖壶菌ATCC 1381的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增FabA基因的上游片段UFabA和下游片段DFabA，上述上游引物对包括上游正向引物和上游反向引物，分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示，下游引物对包括下游正向引物和下游反向引物，分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示；

（2）将上游片段UFabA和下游片段DFabA与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；

（3）将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述敲除载体为pBlu-Zeo。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序包括如下：（1）94℃，5min；（2）94℃，30s；（3）55℃，30s；（4）72℃，1min；（5）重复（2）~（4）35个循环；（6）72℃，10min；（7）4℃保存。

4.一种多不饱和脂肪酸的生产方法，其特征在于：用权利要求1至3中任一权利要求所述构建方法构建的裂殖壶菌工程菌进行发酵生产。

5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将所述裂殖壶菌工程菌接种于液体种子培养基中培养，获得种子培养液；

（2）将步骤（1）所得的种子培养液接种于发酵培养基中培养，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液；

（3）将步骤（3）所得的发酵液中的菌体充分消化，加入正己烷混匀后静置分层，获得有机相，接着用正己烷清洗该有机相至无色，最后去除正己烷，即得所述多不饱和脂肪酸2。

6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于：所述步骤（1）为：将所述裂殖壶菌工程菌接种于液体种子培养基中，于27~29℃，180~220rpm培养24~48h，获得种子培养液。

7.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于：所述步骤（2）为：将步骤（1）所得的种子培养液以3~5%的体积比接种于发酵培养基中，于27~29℃，180~220rpm培养4~6d，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液。