[发明专利]植物次生代谢产物生物合成途径中相关酶类的解析方法

权利要求书

1.下式(I)所示的化合物：

2.一种探针分子，所述探针分子由权利要求1所述的式(I)化合物与报告基团形成，其中，所述报告基团来自用于富集蛋白的报告分子或来自用于示踪蛋白的报告分子，所述报告分子通过点击化学反应与所述式(I)化合物共价连接。

3.如权利要求2所述的探针分子，其特征在于，所述报告分子为生物素或荧光染料。

4.如权利要求3所述的探针分子，其特征在于，所述荧光染料选自：羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、羧基四甲基罗丹明、氟硼荧染料、花菁类染料、Alexa Fluro系列染料。

5.如权利要求4所述的探针分子，其特征在于，所述花菁类染料为Cy3或Cy5；所述AlexaFluro系列染料为Alexa Fluro 488或Alexa Fluro 568。

6.如权利要求2所述的探针分子，其特征在于，所述报告分子为生物素或羧基四甲基罗丹明。

7.一种鉴定功能蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供含有与探针分子结合的目标功能蛋白的蛋白混合物；

(2)富集与所述探针分子结合的蛋白质；

(3)分离、鉴定与所述探针分子结合的蛋白质；和

(4)任选地，表达步骤(3)获得的蛋白质，进行亲和性实验，确认所述蛋白质为待鉴定的功能蛋白；

其中，所述探针分子如权利要求2-6中任一项所述；所述功能蛋白是植物次生代谢合成酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述功能蛋白是来自甜叶菊甜菊糖合成途径的次生代谢合成酶。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括，混合权利要求1所述的式(I)化合物与含有目标功能蛋白的蛋白质混合物，孵育一段时间后进行紫外光照，然后在混合物中加入报告分子，利用点击化学反应将报告分子接入式(I)化合物，从而提供步骤(1)所述的含有与探针分子结合的目标功能蛋白的蛋白混合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有目标功能蛋白的蛋白混合物经高效液相色谱法、高效液相色谱与质谱联用法、气相色谱法、气相色谱与质谱联用法、核磁共振法和高效液相色谱与核磁共振联用法中的一种或多种验证含有目标功能蛋白。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述报告分子为用于示踪靶蛋白的荧光染料，所述步骤(2)包括：通过SDS-PAGE分离富集与所述探针分子结合的蛋白质；或所述报告分子用于富集蛋白，所述步骤(2)包括，通过与该报告分子的特异性结合分子结合而富集与所述探针分子结合的蛋白质。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括进行竞争对照实验和/或空白对照实验的步骤；其中，所述竞争对照实验使用所述功能蛋白的底物与所述探针分子处理所述含有目标功能蛋白的蛋白混合物；所述空白对照未使用所述底物与所述探针分子处理所述含有目标功能蛋白的混合物。

13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的鉴定包括(i)在荧光检测器下检测探针分子标记靶标蛋白的情况，和/或使用考马斯亮蓝染色或者银染与荧光检测结果进行比对；和/或(ii)联用定量蛋白质组学和质谱技术进行鉴定。