[发明专利]汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，及单克隆抗体的应用。

背景技术

汉坦病毒(Hantavirus，HV)属布尼亚病毒科，是一种分节段的单股负链RNA病毒，其会引起汉坦病毒肺综合征(HPS)和汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)等疾病，人和啮齿类动物(特别是鼠)均可被感染，其L、M、S基因分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)、及核衣壳蛋白(NP)。NP又称核蛋白，是病毒的主要结构蛋白，免疫原性强，刺激机体产生的抗体滴度高、维持时间长，在抗病毒免疫中起重要作用，不同株、型的病毒NP氨基酸序列保守，均携带有T细胞和B细胞抗原决定簇，能诱导机体产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，可直接与体外转录病毒的RNA及被感染细胞的细胞器结合，起着调节病毒复制的作用，常用作为HV感染后的诊断蛋白。目前，汉坦病毒感染后的血清学诊断通常采用病毒感染的组织细胞等天然抗原，由于其敏感性、特异性和可操作性不是十分理想，故考虑是否可通过基因克隆与表达来获取具有良好的免疫原性和免疫反应性的重组NP，以替代天然抗原用于HV感染的实验室诊断。同时，在汉坦病毒感染后鼠组织器官标本中抗原检测方面，目前尚没有高特异性和高敏感性的单克隆抗体实际应用于实验室检测，绝大部分均是采用的多克隆抗体，检测结果存在一定的假阳性或假阴性，影响检测结果的准确性。

发明内容

鉴于上述状况，有必要提供一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，以获得具有良好的免疫原性和免疫反应性的汉坦病毒核蛋白，同时制备一种高特异性和高敏感性的抗汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体而便于检测应用。

本发明提供一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物，通过RT－PCR扩增汉坦病毒S基因；将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒；TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，在经IPTG诱导表达，得到包涵体；包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白；GST－NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠；小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；阳性克隆筛选；以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以及效价检测。

进一步地，所述特异性引物包括上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’和下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’。

进一步地，所述将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，再转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒步骤包括：扩增的汉坦病毒S基因与pGM－T载体以1：3的比例于22℃下进行连接反应，取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，抽提质粒，应用试剂盒进行PCR鉴定，应用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃进行双酶切鉴定，以确定得到TA克隆阳性质粒。

进一步地，所述TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S步骤包括：TA克隆阳性质粒与pGEX－6P－2空质粒在37℃条件下进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切、电泳、目的片段回收纯化，二者在1：5比例下应用T4 DNA连接酶于22℃连接反应20min，取一定量的连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑选单克隆菌落，抽提质粒，取1μl进行PCR鉴定，应用EcoRⅠ、XholⅠ对重组质粒pGEX－6P－2/S进行双酶切，PCR产物及酶切产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳，对重组质粒pGEX－6P－2/S进行序列测定。

进一步地，所述包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白步骤，还包括GST－NP重组蛋白纯化、Western blot鉴定、浓度测定步骤。