[发明专利]汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括：

设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物，通过RT－PCR扩增汉坦病毒S基因；

将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒；

TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；

将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，经IPTG诱导表达，得到包涵体；

包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白；

GST－NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠；

小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；

阳性克隆筛选；以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以及效价检测。

2.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述特异性引物包括上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’和下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’。

3.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，再转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒步骤包括：

扩增的汉坦病毒S基因与pGM－T载体以1：3的比例于22℃下进行连接反应，取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，抽提质粒，应用试剂盒进行PCR鉴定，应用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ于37℃进行双酶切鉴定，以确定得到TA克隆阳性质粒。

4.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S步骤包括：

TA克隆阳性质粒与pGEX－6P－2空质粒在37℃条件下进行EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切、电泳、目的片段回收纯化，二者在1：5比例下应用T4DNA连接酶于22℃连接反应20min，取一定量的连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑选单克隆菌落，抽提质粒，取1μl进行PCR鉴定，应用EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ对重组质粒pGEX－6P－2/S进行双酶切，PCR产物及酶切产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳，对重组质粒pGEX－6P－2/S进行序列测定。

5.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白步骤，还包括GST－NP重组蛋白纯化、Western blot鉴定、浓度测定步骤。

6.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述GST－NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠步骤，包括：

以重组蛋白GST－NP为免疫原，免疫小鼠，初次免疫采用1mg/ml浓度的重组蛋白GST－NP0.1ml与等体积完全佐剂注射器混匀，皮内多点注射；21天后采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST－NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀，皮内多点注射，第二次免疫；之后每隔14天采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST－NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀，腹腔直接注射，第三次、第四次免疫；小鼠第四次免疫后第7天眼眶处采血待用，即免疫小鼠血，并分离血清。

7.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养的步骤，包括：小鼠脾细胞的制备、脾细胞与骨髓瘤细胞融合以及选择性培养杂交瘤细胞，重组蛋白GST－NP融合检测。

8.一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用，其特征在于：所述应用为用异硫氰酸荧光素标记所制备的单克隆抗体，再对汉坦病毒感染的阳性动物脏器标本进行检测。