[发明专利]一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用，该方法包括：1)使用冷丙酮沉淀疫苗中的蛋白；2)SDS‑PAGE电泳；3)使用灰度扫描仪对各条带进行灰度扫描；4)结合灰度扫描的结果计算疫苗中蛋白含量和纯度。该方法既解决了油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，也解决了成品兽用油乳剂蛋白亚单位疫苗的质检中使用靶动物进行实验的难题，在抗原蛋白含量的定量及纯度的检测中准确率达到90％以上；且不会导致抗原蛋白的变性降解且易重复；同时通过对得到的抗原蛋白进行一次SDS‑PAGE检测就能够获得油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原蛋白的含量和纯度的结果，节约了成本、劳动力和时间。

技术领域

本发明涉及一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

疫苗是目前预防传染性疾病最有效的方法之一。除安全性外，评价一个疫苗的另一个重要指标就是其免疫原性。传统的减毒活疫苗和灭活疫苗仍然是目前最为常用的疫苗，因为两种疫苗都保持了良好的病毒颗粒性状和病毒表面蛋白，并且减毒活疫苗还能在体内复制，能够有效地诱导中和抗体产生。尽管这两类疫苗目前都得到了广泛的应用，但是其毒力返强和灭活不完全的安全性问题仍然不容忽视，尤其是对于那些生物安全级别很高的病毒；另外，这两类疫苗生产工艺都较为复杂、成本较高。因此，利用重组技术来研发亚单位疫苗是现代疫苗学的一个新的方向和趋势，这类疫苗不含病毒的基因组，是一类相对安全的疫苗。且对于那些我们目前还不能培养和有效扩增的病毒，或者是培养的生物安全级别要求很高的病毒，亚单位疫苗是首要的选择。

基因工程亚单位疫苗(Subunitvaccine)又称重组亚单位疫苗(RecombinantSubunit Vaccines)或生物合成亚单位疫苗，是利用DNA重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体菌(如大肠杆菌)或细胞(如293T细胞)，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原，分离纯化保护性抗原再加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。利用基因工程的方法，不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因，而且能够在体外对其进行改造或修饰，并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，使病毒蛋白获得大量表达。基因工程亚单位疫苗就是将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，再以这种生物合成的基因产物制成的亚单位疫苗。因此，基因工程亚单位疫苗易于大规模生产，且成本低廉。用蛋白作为抗原建立的诊断方法，可以将免疫动物和自然感染动物鉴别开来，不干扰流行病学调查；对于发病急、病程短的疾病效果较好；因此它将成为近期投入市场品种最多的生物高技术产品之一。

在重组蛋白类疫苗的研发中，蛋白抗原与佐剂吸附后的稳定性也是必须的检测指标之一，这就需要准确测定疫苗成品中的抗原含量。而疫苗成品多是抗原蛋白与佐剂吸附后的胶体状复合物，如何采用适当的方法让蛋白抗原与佐剂完全解离且不破坏抗原的性质，是需要重点解决的一个难题。目前的报道中，有采用柠檬酸钠、盐酸胍等方法将蛋白与佐剂解离的方法，但普遍存在解离不完全，解离时间偏长等问题。特别是在油乳剂疫苗中，由于疫苗本身为油状，使用普通方法破乳解离抗原蛋白的得率很低，且容易导致抗原蛋白变性甚至降解。

目前在成品疫苗的质检中，特别是兽用疫苗的质检中，一般采用成品疫苗按照规定的免疫程序免疫靶动物，跟踪后续的抗体效价结果或进行免疫攻毒实验，从而验证本批次疫苗是否符合要求，能否投入市场。因此，找到一种替代方法检测成品疫苗中抗原的含量和纯度是目前兽用疫苗的一个研究重点，这不仅能够节约成本和时间，也能够避免使用动物进行实验，从而节约实验动物的使用量。

发明内容

鉴于上述存在的油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，以及在成品兽用疫苗的质检中使用靶动物进行实验从而导致成本较高、质检时间长，且需要使用很多实验动物的问题，本发明提供了一种快速检测油乳剂亚单位疫苗中抗原含量和纯度的方法。